请提供整合克隆玛格丽特厘米史密斯 资金支持： 加拿大基因组/基因组大草原 NSERC发现和战略项目赠款

1。文化生产<ol><li>准备无菌液体介质：TY 10（5克/ L，蛋白胨，酵母提取物3克/升，0.44克/升的氯化钙脱水），11磅（10克/ L，蛋白胨，5 g / L酵母提取物，5克/氯化钠，pH值7）。 </li><li>从一个单一的殖民地：TY传媒SmUW227（ 根瘤菌的 LP应变：建设将在别处描述，紧张施工细节要求）（）到5毫升50微克/毫升大观接种。接种以下株，到5毫升的LB液体培养基，给予抗生素补充： 大肠杆菌大肠杆菌 DH5α12 pJC2，整合表达载体，含10微克/毫升四环素; E。大肠杆菌 MT616 13日的动员，10微克/毫升氯霉素; 和 E。 大肠杆菌 DH5αpJH110，捐助卡带载体，含有5微克/毫升的庆大霉素。 </li><li>孵育E。在37及隔夜大肠杆菌菌株度;ç不断晃动。孵育S。两天用颤抖的根瘤菌株在30°C。它有可能获得与根瘤菌文化具有较大的接种（1:500饱和文化的亚文化）过夜。 </li></ol> 2。文化的制备和混合<ol><li>每一株洗净文化1.5毫升离心收集细胞沉淀在17000 XG为30秒和1毫升无菌0.85％氯化钠重新悬浮;重复一次。 </li><li> 100无菌0.85％氯化钠液重悬沉淀。 </li><li>个别发现每一个普通的TY琼脂平板上的应变10微升水洗文化。这些点是控制点。 </li><li>加入40μL的每个菌株的大肠杆菌除外大肠杆菌 DH5α含有pJC2在无菌试管，混合，并当场这种混合物120μL纯TY琼脂平板上12。这点是没有整合阴性对照。 </li><li>加入40μl每一株的无菌ţUBE，千姿百态，与现货160μL纯TY琼脂平板上这种混合物。这点是IMCE交配点。 </li><li>允许点干层流罩。 </li><li>密封板和30°C过夜孵育。 </li></ol> 3。隔离跨稳定整合<ol><li>连续控制点和IMCE点到TY平板补充200微克/毫升链霉素（SmUW227菌株Rm1021基于它带有一个突变赋予高级别抗链霉素14）和30微克/毫升的庆大霉素。 </li><li>计算的IMCE效率的，悬浮约¼的的的IMCE交配点，在500μL无菌0.85％氯化钠。 10倍系列稀释至10-7。板稀释到10 10 -2 TY琼脂板补充200微克/毫升链霉素和30微克/毫升庆大霉素，选择跨稳定整合-5。板稀释度10 -3 THRough 10 -7补充200微克/毫升链霉素，选择反式稳定整合和潜在的受助人，即总受助TY琼脂板。 </li><li>对于悬浮隔离的无标记转稳定整合约500μL无菌0.85％氯化钠一季度IMCE交配点。 10倍系列稀释至10-6。板稀释补充200微克/毫升链霉素和200微克/毫升的X GLUC四个TY琼脂板10-4到10-6。 </li><li> 3天在30°C孵育板。 </li><li>查看RFP的反稳定整合在绿光（525纳米），并通过一个红色的过滤器（&gt; 610 nm）的15。 </li><li>计算％IMCE效率，反式稳定整合菌落形成单位相比，总受助人的菌落形成单位。大约一半的反式稳定整合将发生真正的磁带交换，使他们的白色和大观霉素敏感。 </li><li>找到刘元反稳定整合（W，捐助向量在这里不包含像pJH110）屏幕为白色菌落（延长潜伏期，在室温下的额外1-2天，将加强分化的殖民地通过X GLUC的的通用汽车研究，这是必要的， 在 S 根瘤菌 SmUW227），TY琼脂平板上确认没有殖民地的筛选抗生素和TY琼脂板含有100微克/毫升大观霉素的敏感性。 </li></ol> 4。代表结果经过3天的潜伏期上TY辅以链霉素和庆大霉素控制条纹应该没有增长。 IMCE连胜应该有头连胜和图2可以看出，第二连胜的许多殖民地的融合发展。跨国整合的效率，跨稳定整合总受助人的百分比表示，应该在0.5％的范围内。约一半跨稳定整合，将大观霉素敏感和白色显示他们已​​经经历了真正的磁带交换。绿光（525纳米）下，通过一个红色的过滤器（&gt; 610 nm）的15时，，横贯稳定整合包含从pJH110的测试RFP捐助卡带显示有迹可寻RFP的荧光。 <img src="/files/ftp_upload/3698/3698fig1.jpg" alt="图1"/> 图1共轭混合插图：质粒计算机辅助从pRK600转移基因的表达，都是随机从细胞到细胞转移。在混合物中的反式稳定整合创造IMCE，整合（int）的助手的质粒pJC2和捐助质粒pJH110所需的两个质粒通过的LP应变的收购，这种转移的结果。从非复制捐助质粒（pJH110）捐助卡带交换通过ΦC31整合活动的LP，磁带在染色体上的标记，造成损失的LP标记（SPr和uidA基因 ）和捐助卡带（RFP和通用汽车研究）中产生的反式完整之维护。 <img src="/files/ftp_upload/3698/3698fig2.jpg" alt="图2"/> 图2。答 ：非选择性的TY板琼脂表面上呈现出干细胞的混合物。接合点板A：链霉素，庆大霉素-X GLUC的板从顶部挑染的接合点，左顺时针没有整合控制，将与 IMCE 根瘤菌，E.大肠杆菌 DH5α， 大肠杆菌含有pJC2控制大肠杆菌 DH5a含有pJH110控制，E.大肠杆菌 MT616控制，S.根瘤菌 UW227 控制 C：10 -2稀释交配点悬浮上TY链霉素-X GLUC琼脂ð：10 -2上：TY链霉素，庆大霉素- X-GLUC琼脂（蓝色菌落是单一的重组稀释交配点悬浮，白色菌落的真实经历磁带交换） 电子邮件 ：10 -2的交配点悬浮TY链霉素-X GLUC的显示荧光不足的琼脂稀释传真：10 -2交配点悬浮TY链霉素，庆大霉素- X-GLUC两级琼脂稀释荧光（光明殖民地对应蓝色菌落，并具有较高的RFP表达大概是由于虽然读从向量序列，其中殖民地经历真正 ​​的盒式交换包含只有立即启动与招标书没有读通过lac启动子载体，这是不存在的。）。

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没有利益冲突的声明。

该的IMCE技术允许为一个单一的attB两侧LP轨迹以前工程菌的DNA磁带的有效整合。一旦RFP创建捐助盒克隆所需的构造，该技术并不需要随后的DNA纯化和改造，使得它非常健壮。这是至关重要的，包括适当的生长控制，是某些抗生素耐药性是由于建立反稳定整合，而不是其他因素。 IMCE生产效率约0.5％的反式稳定整合。相反，通过同源重组的双重交叉发生在约10 -6?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 试剂名称 </td><td> 公司 </td><td> 目录编号 </td><td> 评论 </td></tr><tr><td>链霉素</td><td> bioshop加拿大公司</td><td> STP101 </td><td></td></tr><tr><td>大观</td><td> bioshop加拿大公司</td><td> <a href="https://ssl34.alentus.com/bioshopcanada/detail.asp?Pin=SPE201">SPE201</a> </td><td></td></tr><tr><td>庆大霉素</td><td> bioshop加拿大公司</td><td> GTA202 </td><td></td></tr><tr><td>氯霉素</td><td> bioshop加拿大公司</td><td> CLR201 </td><td></td></tr><tr><td>四环素</td><td> bioshop加拿大公司</td><td> TET701 </td><td></td></tr><tr><td>卡那霉素</td><td> bioshop加拿大公司</td><td> KAN201 </td><td></td></tr><tr><td>细菌级琼脂</td><td&gt; Bioshop加拿大公司</td><td> AGR001 </td><td></td></tr><tr><td>蛋白胨</td><td> bioshop加拿大公司</td><td> TRP402 </td><td></td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td> bioshop加拿大公司</td><td> YEX401 </td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td> bioshop加拿大公司</td><td> SOD001 </td><td></td></tr><tr><td>氯化钙</td><td> bioshop加拿大公司</td><td> CCL444 </td><td></td></tr><tr><td> X - GLUC </td><td>黄金生物技术公司</td><td> G1281C1 </td><td></td></tr><tr><td> 大肠杆菌 MT616应变</td><td>可要求</td><td></td><td>也可用于我们的实验室之外</td></tr><tr><td> 大肠杆菌 pJC2应变</td><td>在内部，可以通过请求</td><td></td><td></td></tr><tr><td> 大肠杆菌 pJH110应变</td><td>在内部，可以通过requesţ </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SmUW227应变</td><td>在内部，可以通过请求</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

site-specific bacterial chromosome engineering: &#934;c31 integrase mediated cassette exchange (imce)

可用于细菌染色体的稳定保持在大型基地范围内1外源DNA。整合到染色体复制质粒，质粒稳定性，质粒不相容性和质粒拷贝数变异，如规避的问题。这种方法使用从链霉菌噬菌体（Φ）C31的2,3特定地点的整合。 ΦC31整合酶催化两个特定的DNA位点之间的直接重组：attB和attP（34和39个基点，分别）4。此重组是稳定的，并没有恢复5。一个“着陆垫”（LP）的1霉素抗性基因，AADA（SPR），和大肠杆菌组成的序列大肠杆菌 β-葡萄糖醛酸酶基因（uidA基因 ）两侧attP网站已整合到苜蓿根瘤菌，Ochrobactrum anthropi，在区域间的农杆菌染色体， 上午PC轨迹和的TETA轨迹，分别与根瘤菌用于在该协议。捐助动员的载体侧翼1填塞红色荧光蛋白（RFP）基因和抗生素抗性基因的attB网站也已建成。在这个例子中使用庆大霉素的耐药质粒pJH110。使用SPH我和 Pst一所需的结构可能会被替换的RFP基因6另外attB网站两侧，可能是一种人工合成的构造子克隆到动员的载体，如pK19mob 7。由lac启动子驱动的ΦC31整合（克隆pHS62 8）基因的表达质粒pRK7813 9上动员的广泛的寄主范围。 一个tetraparental交配协议用于转移到捐助盒的LP菌株，从而取代捐助卡带在LP序列标记。这些细胞的移植S-稳定整合。横贯稳定整合，形成了0.5％的典型效率。横贯稳定整合通常是发现在第一500-1000菌落筛选抗生素的敏感性，或用5 - 溴-4 - 氯-3 - 吲哚基-β-D-葡萄糖醛酸（X GLUC）蓝白筛选。该协议包含用于创建和隔离跨稳定整合的交配和选拔程序。

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Site-specific Bacterial Chromosome Engineering: &amp;#934;C31 Integrase Mediated Cassette Exchange (IMCE)

描述一个快速和有效的方法融入预制受体菌株，称为停机坪株，外源DNA的利益。该方法允许进入工程着陆垫一个给定的应变轨迹的站点特定的DNA盒的整合，通过共轭ΦC31整合表达。

网站特定的细菌染色体工程：ΦC​​31整合介导的盒式交换（IMCE）

The bacterial chromosome may be used to stably maintain foreign DNA in the mega-base range1. Integration into the chromosome circumvents issues such as ...

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Bioengineering

Site-specific Bacterial Chromosome Engineering: &#934;C31 Integrase Mediated Cassette Exchange (IMCE)

15.5K 次观看.  University of Waterloo. 描述一个快速和有效的方法融入预制受体菌株，称为停机坪株，外源DNA的利益。该方法允许进入工程着陆垫一个给定的应变轨迹的站点特定的DNA盒的整合，通过共轭ΦC31整合表达。

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