蓝藻是光合作用微生物的重要植物，日益被公认为合成生物学和可再生生物技术应用的有用平台。因此，开发强大的技术来简化设计、克隆和将异质DNA引入不同的蓝藻物种非常重要。因此，这项技术演示了一种成熟的方法，称为结合或三联交配，用于将DNA引入不自然可转化的蓝藻物种中。
在从单细胞到多细胞丝状物种的一系列蓝藻菌株中已成功进行结合。如果您是第一次尝试这种技术，请小心处理您的蓝藻和大肠杆菌菌株小心。例如，不要离心超过协议中给出的值，也不要涡旋。
混合细菌和蓝藻对首次使用的人来说可能看起来很奇怪。我们希望，通过展示结合过程，我们将帮助澄清这一点。构造级别 1 组件后，选择适当的级别 T 接受器向量。
选择适当的端链接，将最终一级组件的三个主端与 T 级主干。若要在 T 级中组装一个或多个一级组件，请使用 PBI1 和所需的端链接向量准备反应组合。设置热循环器程序，然后根据手稿进行。
第一天，通过建立Synechocystis PCC 6803或Synechoccccus Elongatus UTEX 2973的新鲜文化来培养蓝藻文化。使用热无菌循环，将细胞从斧头 BG-11 阿加板中刮入，放入 100 毫升圆锥形烧瓶中，其中装满了 50 毫升新鲜 BG-11 介质，以进行接种。将烧瓶放入具有照明的摇培养箱中，在 100 RPM 的 30 摄氏度下生长 Synechocystis PCC 6803 细胞培养。
对于单细胞球菌，UTEX 2973，在 100 RPM 时以 40 摄氏度生长细胞培养。一到两天后，绘制一毫升的细胞培养，并在分光光度计上测量。OD 750 的吸光达到 0.5 到 1.5。
在第二天，在五毫升LB介质中接种含有载体PRK24和PRL528的MC1061大肠杆菌帮助剂菌株，其浓度为每毫升100微克，氯霉素浓度为每毫升25微克。在摇晃的孵化器中，在 225 RPM 下在 37 摄氏度下生长。然后接种含有适当抗生素的5毫升LB介质，用携带T级货物载体的大肠杆菌培养剂。
在摇晃的孵化器中，在 225 RPM 的温度下一夜之间在 37 摄氏度下生长。第三天，在室温下，将帮助器与货物大肠杆菌在3000克的过夜培养，10分钟。在不干扰细胞颗粒的情况下丢弃上一液。
无需抗生素，即可加入五毫升新鲜 LB 介质，清洗颗粒。通过上下轻轻移液和离心机来去除上流液，重新暂停颗粒。重复此洗涤步骤三次，以去除过夜培养中残留的抗生素。
上次洗涤后，将细胞颗粒重新暂停为初始培养量的 LB 介质体积的一半。然后将450微升的帮剂应变与450微升的货运应变在两毫升管中，并在室温下离开。接下来，在室温下将1500克的一毫升蓝藻培养基离心，10分钟，准备蓝藻培养。
然后小心丢弃上一提液，而不干扰细胞颗粒。通过加入相同初始体积的新鲜 BG-11 介质，将颗粒洗涤四次。在两毫升管中加入900微升洗净的蓝藻培养剂，加入900微升的大肠杆菌联合菌株。
通过上下轻轻移液混合文化。在室温下为Synechocystis PCC 6803或两个小时的西内乔克球菌UTEX2973孵育混合物30分钟。在室温下以1，500克离心混合物10分钟。
取出1.6毫升的上一液，并在剩余的上重液中重新暂停颗粒。将一个 0.45 微米膜过滤器放在不带抗生素的 LB BG-11 阿加板上。小心地将 200 微升的大肠杆菌/蓝藻培养物与无菌扩散器或无菌弯曲尖端混合在膜上。
用石蜡膜密封板，将板放入照明培养箱 24 小时。24 小时后，小心地将膜使用火焰灭菌钳转移到含有适当抗生素的新鲜 BG-11 汞板中，以选择货物载体。用石蜡膜密封板，并在与以前相同的条件下孵育，直到菌落出现。
殖民地通常出现在 7-14 天后，Synechocystis PCC 6803 和 3-7 天后，对于西内乔克球菌 Elongatus UTEX 2973。要选择偶体，使用热无菌接种棒，从膜中至少选择两个单独的菌落，并在含有适当抗生素的新BG-11琼脂板上选择两个菌落。然后将一带蓝藻培养素接种到含有5毫升LB培养基的15毫升离心管中，并在225 RPM的温度下在37摄氏度的温度下在震动的培养箱中孵育。
明确的培养证实大肠杆菌没有污染。在7天的足够生长期之后，选择单个斧头菌落，建立液体培养物，用于长期低温储存或随后的实验。本研究论证了金门装配工作流程。
在组装反应转化后，使用标准蓝白对大肠杆菌菌落进行筛选，鉴定成功组装。eYFP 表达式盒在水平一向量和结束链接一个向量然后组装成一个级别 T 接受器向量，以给出向量 cpcBA-eYFP。通过限制性消化验证了组装的cPCBA-eYFP向量。
cpcBA-eYFP 或 pPMQAK1-T 载体的成功夫妻转移导致 Synechocystis PCC 6803 和 Synechoccus Elongatus UTEX 2973 的膜上多达几百个菌落的生长。与负对照相比，对于强Pcpc560启动子的预期，来自板读卡器的规范化eYFP荧光值和流量细胞仪中每个细胞的eYFP荧光值都很高。使用板读卡器和流式细胞仪时，在单子球菌 UTEX 2973 中，荧光值高于 Synechocystis PCC 6803 中的荧光值。
确保你孵育的最小时间，根据你所结合的应变。
