لسميث CM مارجريت لتوفير يرجى استنساخ integrase بتمويل من: الجينوم كندا / الجينوم المرج NSERC اكتشاف ومنح المشروع الاستراتيجي

1. إنتاج الثقافة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد وسائل الاعلام سائل معقم: TY 10 (5 جم / لتر تريبتون (3)، خلاصة الخميرة غرام / لتر، 0،44 كلوريد الكالسيوم غرام / لتر يذوى)، وLB 11 (10 جم / لتر تريبتون (5)، خلاصة الخميرة غرام / لتر، 5 ز / كلوريد الصوديوم، ودرجة الحموضة 7). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطعيم من مستعمرة واحدة: SmUW227 (S. meliloti LP-السلالة: سيتم وصف البناء في مكان آخر، توتر تفاصيل البناء متوفرة عند الطلب) () في 5 مل من وسائل الاعلام TY مع 50 ميكروغرام / مل سبكتينوميسين. تطعيم السلالات التالية في 5 مل من وسائل الاعلام سائل LB، المكمل مع مضاد حيوي معين: E. كولاي DH5α 12 التي تحتوي على pJC2، والتعبير integrase البلازميد، مع 10 ميكروغرام / مل التتراسيكلين، E. كولاي MT616 13، والتعبئة، مع 10 ميكروغرام / مل الكلورامفينيكول، وهاء. كولاي DH5α تحتوي على pJH110، وكاسيت المانحة البلازميد، مع 5 ميكروغرام / مل الجنتاميسين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان E. سلالات بكتيريا بين عشية وضحاها في 37 ودرجة؛ C مع الهز المستمر. احتضان س. meliloti السلالة في درجة حرارة 30 مئوية لمدة يومين مع اهتزاز. فمن الممكن الحصول على س. meliloti ثقافة بين عشية وضحاها مع أكبر اللقاح (1:500 ثقافة فرعية من ثقافة مشبعة). </li></ol> 2. التحضير والثقافة، وخلط <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل 1.5 مل من ثقافة لكل سلالة من خلال جمع بيليه الخلية عن طريق الطرد المركزي في 17000 XG لمدة 30 ثانية وresuspending في 1 مل من كلوريد الصوديوم العقيمة 0.85٪، كرر مرة واحدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend بيليه في 100 ميكرولتر من كلوريد الصوديوم العقيمة 0.85٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بقعة على حدة 10 ميكرولتر من ثقافة المغسول لكل من الضغط على لوحة سهل أجار TY. هذه البقع هي بقع السيطرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اضافة 40 ميكرولتر من كل سلالة باستثناء E. كولاي DH5α 12 التي تحتوي على pJC2 في أنبوب معقم، مزيج، وبقعة 120 ميكروليتر من هذا الخليط على طبق سهل أجار TY. هذا المكان هو التحكم عدم integrase سلبي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اضافة 40 ميكرولتر من كل سلالة في تي معقمUBE، مزيج، وبقعة 160 ميكروليتر من هذا الخليط على طبق سهل أجار TY. هذا المكان هو المكان التزاوج IMCE. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح للبقع لتجف في غطاء محرك السيارة تدفق رقائقي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحات ختم واحتضانها في 30 درجة مئوية خلال الليل. </li></ol> 3. من العزلة عبر integrants <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بقع سيطرة خط وبقعة IMCE على لوحات أجار TY تستكمل مع 200 ميكروغرام / مل ستربتوميسين (يستند على SmUW227 Rm1021 الذي يحمل طفرة تمنح رفيع المستوى المقاومة للستربتومايسين 14) و 30 جنتاميسين ميكروغرام / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لحساب كفاءة IMCE، resuspend ما يقرب من ربع من بقعة التزاوج IMCE في 500 كلوريد الصوديوم العقيمة ميكروليتر 0.85٪. جعل 10 أضعاف التخفيفات المسلسل إلى 10 -7. التخفيفات لوحة خلال 10 -2 10 -5 على لوحات أجار TY تستكمل مع 200 ميكروغرام / الستربتومايسين مل و 30 ميكروغرام / مل الجنتاميسين، لاختيار لعبر integrants. التخفيفات لوحة 10 عبتي -3ough 10 -7 على لوحات أجار TY تستكمل مع 200 ميكروغرام / مل الستربتومايسين، لاختيار لintegrants على حد سواء عبر والمستفيدين المحتملين، أي مجموع المتلقين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لعزل integrants عبر markerless resuspend ما يقرب من ربع بقعة التزاوج IMCE في 500 ميكرولتر من كلوريد الصوديوم العقيمة 0.85٪. جعل 10 أضعاف التخفيفات المسلسل إلى 10 -6. التخفيفات لوحة 10 -4 إلى 10 -6 على أربع لوحات أجار TY تستكمل مع 200 ميكروغرام / الستربتومايسين مل و 200 ميكروغرام / مل X-الحلاوة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لوحات في درجة حرارة 30 مئوية لمدة 3 أيام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رأي RFP عبر integrants تحت الضوء الأخضر (525 نانومتر)، وخلال مرشح أحمر (&gt; 610 نانومتر) 15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب كفاءة IMCE في المئة كما CFU العابرة للintegrants مقارنة CFU من مجموع المستفيدين. سيكون قد مر ما يقرب من نصف عبر integrants صحيح تبادل كاسيت جعلها بيضاء وسبكتينوميسين الحساسة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للعثور على markerless عبر integrants (ثهنا الموجه من الجهات المانحة لا يحتوي على جم R مثل في pJH110) شاشة لمستعمرة بيضاء (فترة الحضانة الطويلة، 1-2 أيام إضافية في درجة حرارة الغرفة، من شأنها تعزيز التفريق بين المستعمرات عبر X-الحلاوة، وهذا أمر ضروري في س. meliloti SmUW227)، يؤكد حساسية للمستعمرة سبكتينوميسين بواسطة فحص على صفيحة أجار TY بدون المضادات الحيوية، والتي تحتوي على لوحة أجار TY 100 ميكروغرام / مل سبكتينوميسين. </li></ol> 4. ممثل النتائج بعد ثلاثة أيام من حضانة في TY تستكمل مع الستربتوميسين والجنتاميسين ينبغي أن الشرائط السيطرة على أي نمو. يجب أن يكون خط IMCE نمو متكدسة على خط الرأس والعديد من المستعمرات على خط الثاني، كما رأينا في الشكل رقم 2. وينبغي أن كفاءة التكامل العابر، معبرا عنه كنسبة مئوية من عبر integrants للمتلقين مجموع، يكون في حدود 0.5٪. ما يقرب من نصف عبر integrants سبكتينوميسين تكون حساسة وأبيضيصور خضعوا لمدى صحتها تبادل كاسيت. وينبغي عبر integrants يحتوي على الجهات المانحة طلب تقديم العروض اختبار كاسيت من pJH110 عرض ملموس RFP مضان عند عرضها تحت الضوء الأخضر (525 نانومتر)، وخلال مرشح أحمر (&gt; 610 نانومتر) 15. <img src="/files/ftp_upload/3698/3698fig1.jpg" alt="الشكل 1"/> . الرقم خليط الإقتران 1 التوضيح: بمساعدة من التعبير عن الجينات نقل من pRK600، يتم نقل كل من البلازميدات عشوائيا من خلية الى أخرى. هذا نقل النتائج في خلق عبر integrants في الخليط، من خلال اكتساب ليرة لبنانية، وسلالة من البلازميدات 2 اللازمة لIMCE، وintegrase (INT) pJC2 المساعد البلازميد وpJH110 المانحة البلازميد. يتم تبادل كاسيت المانحة من الجهة المانحة عدم تكرار البلازميد (pJH110) عن طريق النشاط integrase ΦC31 مع علامات للكاسيت ليرة لبنانية على الكروموزوم، مما أدى إلى خسارة من العلامات، ليرة لبنانية (SPص وuidA) والحفاظ على كاسيت المانحة (RFP و r جنرال موتورز) في مكمل العابر الناتج. <img src="/files/ftp_upload/3698/3698fig2.jpg" alt="الشكل 2"/> الشكل 2. ج: B التزاوج لوحة بقعة على طبق من ذهب TY غير انتقائية تظهر مخاليط خلية جافة على سطح أجار: ترك بقع التزاوج مجزع على الستربتومايسين جنتاميسين-X-الحلاوة لوحة، من أعلى في اتجاه عقارب الساعة لا سيطرة integrase، IMCE إلى س. meliloti، E. كولاي DH5α تحتوي على pJC2 مراقبة، E. كولاي DH5a تحتوي على pJH110 مراقبة، E. كولاي MT616 السيطرة، وS. . meliloti UW227 سيطرة C: 10 -2 التخفيف من إعادة تعليق بقعة التزاوج في TY الستربتومايسين-X-الحلاوة أجار D:. 10 -2 التخفيف من إعادة تعليق بقعة التزاوج على أجار الستربتومايسين، جنتاميسين-X-الحلاوة TY (المستعمرات الزرقاء هي recombinants واحد، خضعت المستعمرات البيضاء صحيح. تبادل كاسيت) E: 10 -2 التخفيف من إعادة تعليق بقعة التزاوج على أجار الستربتومايسين-X-الحلاوة TY تبين عدم وجود مضان F:. 10 -2 التخفيف من إعادة تعليق بقعة التزاوج على أجار الستربتومايسين، جنتاميسين-X-الحلاوة TY تظهر على مستويين من مضان (أكثر إشراقا المستعمرات تتوافق مع المستعمرات الزرقاء ويكون أعلى طلب تقديم العروض التعبير يفترض أن يعود إلى مروج للقراءة على الرغم من تسلسل ناقلات، حيث المستعمرات بعد أن خضع الحقيقية تبادل كاسيت تحتوي على طلب تقديم العروض مع مروج لها فقط مع فوري من خلال قراءة أي من المروج في أمريكا اللاتينية والكاريبي الناقل، والذي هو غائب).

<ol>
	<li>Itaya, M., Tsuge, K., Koizumi, M., Fujita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+two+genomes+in+one+cell:+Stable+cloning+of+the+Synechocystis+PCC6803+genome+in+the+Bacillus+subtilis+168+genome.">Combining two genomes in one cell: Stable cloning of the Synechocystis PCC6803 genome in the Bacillus subtilis 168 genome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 15971-15976 (2005).</li><li>Kushtoss, S., Rao, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+Integration+Function+of+the+Streptomycete+Bacteriophage+FC31.">Analysis of the Integration Function of the Streptomycete Bacteriophage FC31.</a> J. Mol. Biol. 222, 897-908 (1991).</li><li>Brown, W. R., Lee, N. C., Xu, Z., Smith, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serine+recombinases+as+tools+for+genome+engineering.">Serine recombinases as tools for genome engineering.</a> Methods. 53, 372-379 (2011).</li><li>Groth, A. C., Olivares, E. C., Thyagarajan, B., Calos, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phage+integrase+directs+efficient+site-specific+integration+in+human+cells.">A phage integrase directs efficient site-specific integration in human cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 5995-6000 (2000).</li><li>Rowley, P. A., Smith, M. C., Younger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+motif+in+the+C-terminal+domain+of+FC31+integrase+controls+the+directionality+of+recombination.">A motif in the C-terminal domain of FC31 integrase controls the directionality of recombination.</a> Nuc. Acid. Res. 36, 3879-3891 (2008).</li><li>Campbell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+monomeric+red+fluorescent+protein.">A monomeric red fluorescent protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 7877-7882 (2002).</li><li>Schafer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+mobilizable+multi-purpose+cloning+vectors+derived+from+the+Escherichia+coli+plasmids+pK18+and+pK19:+selection+of+defined+deletions+in+the+chromosome+of+Corynebacterium+glutumicum.">Small mobilizable multi-purpose cloning vectors derived from the Escherichia coli plasmids pK18 and pK19: selection of defined deletions in the chromosome of Corynebacterium glutumicum.</a> Gene. 145, 69-73 (1994).</li><li>Thorpe, H. M., Smith, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+site-specific+integration+of+bacteriophage+DNA+catalyzed+by+a+recombinase+of+the+resolvase&#47;invertase+family.">In vitro site-specific integration of bacteriophage DNA catalyzed by a recombinase of the resolvase&#47;invertase family.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 95, 5505-5510 (1998).</li><li>Jones, J. D., Gutterson, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+mobilizable+cosmid+vector,+pRK7813,+and+its+use+in+a+rapid+method+for+marker+exchange+in+Pseudomonas+fluorescens+strain+HV37a.">An efficient mobilizable cosmid vector, pRK7813, and its use in a rapid method for marker exchange in Pseudomonas fluorescens strain HV37a.</a> Gene. 61, 299-306 (1987).</li><li>Beringer, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=R+Factor+transfer+in+Rhizobium+leguminosarum.">R Factor transfer in Rhizobium leguminosarum.</a> J. Gen. Microbiol. 84, 188-198 (1974).</li><li>Lennox, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transduction+of+linked+genetic+characters+of+the+host+by+bacteriophage+P1.">Transduction of linked genetic characters of the host by bacteriophage P1.</a> Virology. 1, 190-206 (1955).</li><li>Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+transformation+of+Escherichia+coli+with+plasmids.">Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids.</a> J. Mol. Biol. 166, 557-580 (1983).</li><li>Charles, T. C., Finan, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+map+of+Rhizobium+meliloti+megaplasmid+pRmeSU47b.">Genetic map of Rhizobium meliloti megaplasmid pRmeSU47b.</a> J. Bacteriol. 172, 2469-2476 (1990).</li><li>Leigh, J. A., Signer, E. R., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exopolysaccharide-deficient+mutants+of+Rhizobium+meliloti+that+form+ineffective+nodules.">Exopolysaccharide-deficient mutants of Rhizobium meliloti that form ineffective nodules.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 6231-6235 (1985).</li><li>Heil, J. R., Nordeste, R. F., Charles, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fluorescence+theatre:+a+cost-effective+device+using+theatre+gels+for+fluorescent+protein+and+dye+screening.">The fluorescence theatre: a cost-effective device using theatre gels for fluorescent protein and dye screening.</a> Can. J. Microbiol. 57, 339-342 (2011).</li><li>Datsenko, K. A., Wanner, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+inactivation+of+chromosomal+genes+in+Escherichia+coli+K-12+using+PCR+products.">One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-6645 (2000).</li><li>Lesic, B., Rahme, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+lambda+Red+recombinase+system+to+rapidly+generate+mutants+in+Pseudomonas+aeruginosa.">Use of the lambda Red recombinase system to rapidly generate mutants in Pseudomonas aeruginosa.</a> BMC Mol. Biol.. 9, 20-20 (2008).</li><li>Choi, K. -. H., Schweizer, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mini-Tn7+insertion+in+bacteria+with+single+attTn7+sites:+example+Pseudomonas+aeruginosa.">mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa.</a> Nat. Protocols. 1, 153-161 (2006).</li><li>Thomason, L. C., Calendar, R., Ow, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+insertion+and+replacement+in+Schizosaccharomyces+pombe+mediated+by+the+Streptomyces+bacteriophage+FC31+site-specific+recombination+system.">Gene insertion and replacement in Schizosaccharomyces pombe mediated by the Streptomyces bacteriophage FC31 site-specific recombination system.</a> Molecular Genetics and Genomics. 265, 1031-1038 (2001).</li><li>Katzen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gateway+recombinational+cloning:+a+biological+operating+system.">Gateway recombinational cloning: a biological operating system.</a> Expert Opin. Drug Discovery. , 571-586 (2007).</li><li>Charles, T. C., Doty, S. L., Nester, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+Agrobacterium+strains+by+electroporation+of+genomic+DNA+and+its+utility+in+analysis+of+chromosomal+virulence+mutations.">Construction of Agrobacterium strains by electroporation of genomic DNA and its utility in analysis of chromosomal virulence mutations.</a> Appl. Environ. Microbiol. 60, 4192-4194 (1994).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

تقنية IMCE يسمح التكامل الفعال للشريط الحمض النووي واحد attB يحيط في المكان، ليرة لبنانية من سلالة هندسيا سابقا. بمجرد أن يتم استنساخ التصور المطلوب بدلا من طلب تقديم العروض لإنشاء كاسيت المانحة، وهذه التقنية لا تتطلب اللاحقة تنقية الحمض النووي، وتحول، مما يج?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> الستربتومايسين عقار طبي </td><td> Bioshop كندا المؤتمر الوطني العراقي. </td><td> STP101 </td><td></td></tr><tr><td> سبكتينوميسين </td><td> Bioshop كندا المؤتمر الوطني العراقي. </td><td> <a href="https://ssl34.alentus.com/bioshopcanada/detail.asp?Pin=SPE201">SPE201</a> </td><td></td></tr><tr><td> جنتاميسين </td><td> Bioshop كندا المؤتمر الوطني العراقي. </td><td> GTA202 </td><td></td></tr><tr><td> Choramphenicol </td><td> Bioshop كندا المؤتمر الوطني العراقي. </td><td> CLR201 </td><td></td></tr><tr><td> التتراسيكلين </td><td> Bioshop كندا المؤتمر الوطني العراقي. </td><td> TET701 </td><td></td></tr><tr><td> الكانامايسين </td><td> Bioshop كندا المؤتمر الوطني العراقي. </td><td> KAN201 </td><td></td></tr><tr><td> الصف أجار البكتريولوجية </td><td&gt; Bioshop كندا المؤتمر الوطني العراقي. </td><td> AGR001 </td><td></td></tr><tr><td> تريبتون </td><td> Bioshop كندا المؤتمر الوطني العراقي. </td><td> TRP402 </td><td></td></tr><tr><td> خلاصة الخميرة </td><td> Bioshop كندا المؤتمر الوطني العراقي. </td><td> YEX401 </td><td></td></tr><tr><td> كلوريد الصوديوم </td><td> Bioshop كندا المؤتمر الوطني العراقي. </td><td> SOD001 </td><td></td></tr><tr><td> كلوريد الكالسيوم </td><td> Bioshop كندا المؤتمر الوطني العراقي. </td><td> CCL444 </td><td></td></tr><tr><td> X-الحلاوة </td><td> الذهب شركة التكنولوجيا الحيوية </td><td> G1281C1 </td><td></td></tr><tr><td> كولاي MT616 سلالة </td><td> متوفرة عند الطلب </td><td></td><td> تستخدم أيضا خارج من مختبرنا </td></tr><tr><td> كولاي pJC2 سلالة </td><td> في المنزل، والمتاحة حسب الطلب </td><td></td><td></td></tr><tr><td> كولاي pJH110 سلالة </td><td> في المنزل، والمتاحة من قبل requesتي </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SmUW227 سلالة </td><td> في المنزل، والمتاحة حسب الطلب </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

site-specific bacterial chromosome engineering: &#934;c31 integrase mediated cassette exchange (imce)

ويمكن استخدام الكروموسوم البكتيري للحفاظ على ستابلي الحمض النووي الأجنبية في نطاق الضخمة قاعدة 1. الاندماج في كروموسوم تلتف حول قضايا من قبيل التكرار البلازميد والاستقرار البلازميد، عدم التوافق البلازميد، والبلازميد التباين في عدد النسخ. هذا الأسلوب يستخدم integrase في مواقع محددة من بالعاثية المتسلسلة (Φ) C31 2،3. وintegrase ΦC31 يحفز إعادة التركيب مباشرة بين موقعين DNA محددة: attB وattP (34 و BP 39، على التوالي) 4. هذا التوحد هو مستقر ولا تعود 5. A &quot;مهبط&quot; (LP) التي تتكون من تسلسل الجين سبكتينوميسين للمقاومة، aadA (SPR)، وهاء في تم دمج القولونية ß غلوكورونيداز الجين (uidA) يحيط بها مواقع attP في صبغيات meliloti Sinorhizobium، anthropi Ochrobactrum، والأجرعية المورمة في المنطقة بين الجينات، وأناPC مكان، ومكان تيتا، على التوالي. س. ويستخدم meliloti في هذا البروتوكول. كما تم ناقلات المانحة للتعبئة التي تحتوي على مواقع attB المرافقة أحمر فلوري ستوفير بروتين (RFP) الجينات والجينات المقاومة للمضادات الحيوية التي شيدت. في هذا المثال يتم استخدام الجنتاميسين pJH110 البلازميد المقاوم. قد يتم استبدال الجين RFP 6 مع تأنشا المطلوب باستخدام SPH أنا أولا والباسيفيكي بدلا من ذلك قد تأنشا الاصطناعية يحيط بها مواقع attB تكون شبه مستنسخ في ناقلات للتعبئة مثل pK19mob 7. هو الدافع وراء التعبير عن الجينات integrase ΦC31 (المستنسخة من pHS62 8) من قبل مروج أمريكا اللاتينية والكاريبي، على نطاق واسع المضيفة للتعبئة البلازميد pRK7813 9. ويستخدم بروتوكول التزاوج tetraparental لنقل كاسيت المانحة إلى سلالة ليرة لبنانية وبذلك يحل محل علامات في تسلسل ليرة لبنانية مع كاسيت المانحة. هذه الخلايا هي ترانS-integrants. وتتشكل عبر integrants مع كفاءة نموذجي من 0.5٪. وتوجد عادة عبر integrants ضمن المستعمرات 500-1،000 1 فحص الحساسية للمضادات الحيوية أو بواسطة فحص الأزرق والأبيض باستخدام 5-برومو-4-كلورو-3-indolyl بيتا-D-حمض الغلوكورونيك (X-الحلاوة). هذا البروتوكول يتضمن إجراءات التزاوج واختيار لخلق وعزل عبر integrants.

Watch this Scientific Journal Video about Site-specific Bacterial Chromosome Engineering: Î¦C31 Integrase Mediated Cassette Exchange IMCE at JoVE.com

Site-specific Bacterial Chromosome Engineering: &amp;#934;C31 Integrase Mediated Cassette Exchange (IMCE)

ووصف طريقة سريعة وفعالة لدمج الحمض النووي الأجنبية ذات الاهتمام إلى سلالات متقبل مسبقة الصنع، ووصف سلالات مهبط،. أسلوب يسمح للموقع المحدد التكامل من شريط الحمض النووي في مكان الهبوط وسادة هندسيا من سلالة معينة، من خلال تصريف الافعال والتعبير عن integrase ΦC31.

موقع محدد الهندسة الكروموسوم البكتيري: ΦC31 كاسيت الموفقة تبادل Integrase (IMCE)

The bacterial chromosome may be used to stably maintain foreign DNA in the mega-base range1. Integration into the chromosome circumvents issues such as ...

site-specific-bacterial-chromosome-engineering-c31-integrase-mediated

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Site-specific Bacterial Chromosome Engineering: &#934;C31 Integrase Mediated Cassette Exchange (IMCE)

15.5K Views.  University of Waterloo. ووصف طريقة سريعة وفعالة لدمج الحمض النووي الأجنبية ذات الاهتمام إلى سلالات متقبل مسبقة الصنع، ووصف سلالات مهبط،. أسلوب يسمح للموقع المحدد التكامل من شريط الحمض النووي في مكان الهبوط وسادة هندسيا من سلالة معينة، من خلال تصريف الافعال والتعبير عن integrase ΦC31.

Video: Site-specific Bacterial Chromosome Engineering: &#934;C31 Integrase Mediated Cassette Exchange (IMCE)

Procedure for Lung Engineering

Lung tissue, including lung cancer and chronic lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease, cumulatively account for some 280,000 deaths annually; chronic obstructive pulmonary disease is currently the fourth leading cause of death in the United States1. Contributing to this mortality is the fact that lungs do not generally repair or regenerate beyond the microscopic, cellular level. Therefore, lung tissue that is damaged by degeneration or infection, or lung tissue that is surgically resected is not functionally replaced in vivo. To explore whether lung tissue can be generated in vitro, we treated lungs from adult rats using a procedure that removes cellular components to produce an acellular lung extracellular matrix scaffold. This scaffold retains the hierarchical branching structures of airways and vasculature, as well as a largely intact basement membrane, which comprises collagen IV, laminin, and fibronectin. The scaffold is mounted in a bioreactor designed to mimic critical aspects of lung physiology, such as negative pressure ventilation and pulsatile vascular perfusion. By culturing pulmonary epithelium and vascular endothelium within the bioreactor-mounted scaffold, we are able to generate lung tissue that is phenotypically comparable to native lung tissue and that is able to participate in gas exchange for short time intervals (45-120 minutes). These results are encouraging, and suggest that repopulation of lung matrix is a viable strategy for lung regeneration. This possibility presents an opportunity not only to work toward increasing the supply of lung tissue for transplantation, but also to study respiratory cell and molecular biology in vitro for longer time periods and in a more accurate microenvironment than has previously been possible.

We have developed a decellularized lung extracellular matrix and novel biomimetic bioreactor that can be used to generate functional lung tissue. By seeding cells into the matrix and culturing in the bioreactor, we generate tissue that demonstrates effective gas exchange when transplanted in vivo for short periods of time.

الداخلي للهندسة الرئة

Lung tissue, including lung cancer and chronic lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease, cumulatively account for some 280,000 deaths ...

Characterizing Bacterial Volatiles using Secondary Electrospray Ionization Mass Spectrometry (SESI-MS)

Secondary electrospray ionization mass spectrometry (SESI-MS) is a method developed for the rapid detection of volatile compounds, without the need for sample pretreatment. The method was first described by Fenn and colleagues1 and has been applied to the detection of illicit drugs2 and explosives3-4, the characterization of skin volatiles5, and the analysis of breath6-7.
SESI ionization occurs by proton transfer reactions between the electrospray solution and the volatile analyte, and is therefore suitable for the analysis of hetero-organic molecules, just as in traditional electrospray ionization (ESI). However, unlike standard ESI, the proton transfer process of SESI occurs in the vapor phase rather than in solution (Fig. 1), and therefore SESI is best suited for detecting organic volatiles and aerosols.
We are expanding the use of SESI-MS to the detection of bacterial volatiles as a method for bacterial identification and characterization8. We have demonstrated that SESI-MS volatile fingerprinting, combined with a statistical analysis method, can be used to differentiate bacterial genera, species, and mixed cultures in a variety of growth media.8 Here we provide the steps for obtaining bacterial volatile fingerprints using SESI-MS, including the instrumental parameters that should be optimized to ensure robust bacterial identification and characterization.

Characterizing Bacterial Volatiles using Secondary Electrospray Ionization Mass Spectrometry SESI-MS

Secondary electrospray ionization mass spectrometry (SESI-MS) enables the detection of volatile organic compounds (VOCs) without the need for any sample pretreatment. This protocol provides instructions for the rapid (within minutes) characterization of bacterial VOCs using SESI-MS.

تميز باستخدام مواد متطايرة الجرثومي الثانوي قداس الطيف Electrospray التأين (سيسي - MS)

Secondary electrospray ionization mass spectrometry (SESI-MS) is a method developed for the rapid detection of volatile compounds, without the need for ...

High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays (MEA)

The discovery of RNAi pathway in eukaryotes and the subsequent development of RNAi agents, such as siRNA and shRNA, have achieved a potent method for silencing specific genes1-8 for functional genomics and therapeutics. A major challenge involved in RNAi based studies is the delivery of RNAi agents to targeted cells. Traditional non-viral delivery techniques, such as bulk electroporation and chemical transfection methods often lack the necessary spatial control over delivery and afford poor transfection efficiencies9-12. Recent advances in chemical transfection methods such as cationic lipids, cationic polymers and nanoparticles have resulted in highly enhanced transfection efficiencies13. However, these techniques still fail to offer precise spatial control over delivery that can immensely benefit miniaturized high-throughput technologies, single cell studies and investigation of cell-cell interactions. 
Recent technological advances in gene delivery have enabled high-throughput transfection of adherent cells14-23, a majority of which use microscale electroporation. Microscale electroporation offers precise spatio-temporal control over delivery (up to single cells) and has been shown to achieve high efficiencies19, 24-26. Additionally, electroporation based approaches do not require a prolonged period of incubation (typically 4 hours) with siRNA and DNA complexes as necessary in chemical based transfection methods and lead to direct entry of naked siRNA and DNA molecules into the cell cytoplasm. As a consequence gene expression can be achieved as early as six hours after transfection27. Our lab has previously demonstrated the use of microelectrode arrays (MEA) for site-specific transfection in adherent mammalian cell cultures17-19. In the MEA based approach, delivery of genetic payload is achieved via localized micro-scale electroporation of cells. An application of electric pulse to selected electrodes generates local electric field that leads to electroporation of cells present in the region of the stimulated electrodes. The independent control of the micro-electrodes provides spatial and temporal control over transfection and also enables multiple transfection based experiments to be performed on the same culture increasing the experimental throughput and reducing culture-to-culture variability. 
Here we describe the experimental setup and the protocol for targeted transfection of adherent HeLa cells with a fluorescently tagged scrambled sequence siRNA using electroporation. The same protocol can also be used for transfection of plasmid vectors. Additionally, the protocol described here can be easily extended to a variety of mammalian cell lines with minor modifications. Commercial availability of MEAs with both pre-defined and custom electrode patterns make this technique accessible to most research labs with basic cell culture equipment.

High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays MEA

The article details the protocol for site-specific transfection of scrambled sequence of siRNA in an adherent mammalian cell culture using a microelectrode array (MEA).

عالية الكفاءة، ومواقع محددة ترنسفكأيشن من الخلايا تمسكا مع سيرنا باستخدام صفائف مسرى مكروي (MEA)

The discovery of RNAi pathway in eukaryotes and the subsequent development of RNAi agents, such as siRNA and shRNA, have achieved a potent method for ...

Capillary Force Lithography for Cardiac Tissue Engineering

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical discoveries with the aims of developing functional tissues for cardiac regeneration as well as in vitro screening assays. However, the ability to create high-fidelity models of heart tissue has proven difficult. The heart&#8217;s extracellular matrix (ECM) is a complex structure consisting of both biochemical and biomechanical signals ranging from the micro- to the nanometer scale2. Local mechanical loading conditions and cell-ECM interactions have recently been recognized as vital components in cardiac tissue engineering3-5.
A large portion of the cardiac ECM is composed of aligned collagen fibers with nano-scale diameters that significantly influences tissue architecture and electromechanical coupling2. Unfortunately, few methods have been able to mimic the organization of ECM fibers down to the nanometer scale. Recent advancements in nanofabrication techniques, however, have enabled the design and fabrication of scalable scaffolds that mimic the in vivo structural and substrate stiffness cues of the ECM in the heart6-9.
Here we present the development of two reproducible, cost-effective, and scalable nanopatterning processes for the functional alignment of cardiac cells using the biocompatible polymer poly(lactide-co-glycolide) (PLGA)8 and a polyurethane (PU) based polymer. These anisotropically nanofabricated substrata (ANFS) mimic the underlying ECM of well-organized, aligned tissues and can be used to investigate the role of nanotopography on cell morphology and function10-14.
Using a nanopatterned (NP) silicon master as a template, a polyurethane acrylate (PUA) mold is fabricated. This PUA mold is then used to pattern the PU or PLGA hydrogel via UV-assisted or solvent-mediated capillary force lithography (CFL), respectively15,16. Briefly, PU or PLGA pre-polymer is drop dispensed onto a glass coverslip and the PUA mold is placed on top. For UV-assisted CFL, the PU is then exposed to UV radiation (&#955; = 250-400 nm) for curing. For solvent-mediated CFL, the PLGA is embossed using heat (120 &#176;C) and pressure (100 kPa). After curing, the PUA mold is peeled off, leaving behind an ANFS for cell culture. Primary cells, such as neonatal rat ventricular myocytes, as well as human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes, can be maintained on the ANFS2.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of biomimetic cardiac cell culture substrata made from two distinct polymeric materials using capillary force lithography. The described methods provide a scalable, cost-effective technique to engineer the structure and function of macroscopic cardiac tissues for in vitro and in vivo applications.

الشعرية قوة الطباعة الحجرية لهندسة الأنسجة القلبية

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical ...

Observing and Quantifying Fibroblast-mediated Fibrin Gel Compaction

Cells embedded in collagen and fibrin gels attach and exert traction forces on the fibers of the gel. These forces can lead to local and global reorganization and realignment of the gel microstructure. This process proceeds in a complex manner that is dependent in part on the interplay between the location of the cells, the geometry of the gel, and the mechanical constraints on the gel. To better understand how these variables produce global fiber alignment patterns, we use time-lapse differential interference contrast (DIC) microscopy coupled with an environmentally controlled bioreactor to observe the compaction process between geometrically spaced explants (clusters of fibroblasts). The images are then analyzed with a custom image processing algorithm to obtain maps of the strain. The information obtained from this technique can be used to probe the mechanobiology of various cell-matrix interactions, which has important implications for understanding processes in wound healing, disease development, and tissue engineering applications.

Time-lapse microscopy and image processing techniques were used to observe and analyze fibroblast-mediated gel compaction and fibrin fiber realignment in an environmentally controlled bioreactor over a 48 hr&#160;period.

مراقبة وقياس حجم فيبرين جل ضغط الخلايا الليفية بوساطة

Cells embedded in collagen and fibrin gels attach and exert traction forces on the fibers of the gel. These forces can lead to local and global ...

Manufacturing Of Robust Natural Fiber Preforms Utilizing Bacterial Cellulose as Binder

A novel method of manufacturing rigid and robust natural fiber preforms is presented here. This method is based on a papermaking process, whereby loose and short sisal fibers are dispersed into a water suspension containing bacterial cellulose. The fiber and nanocellulose suspension is then filtered (using vacuum or gravity) and the wet filter cake pressed to squeeze out any excess water, followed by a drying step. This will result in the hornification of the bacterial cellulose network, holding the loose natural fibers together.
Our method is specially suited for the manufacturing of rigid and robust preforms of hydrophilic fibers. The porous and hydrophilic nature of such fibers results in significant water uptake, drawing in the bacterial cellulose dispersed in the suspension. The bacterial cellulose will then be filtered against the surface of these fibers, forming a bacterial cellulose coating. When the loose fiber-bacterial cellulose suspension is filtered and dried, the adjacent bacterial cellulose forms a network and hornified to hold the otherwise loose fibers together.
The introduction of bacterial cellulose into the preform resulted in a significant increase of the mechanical properties of the fiber preforms. This can be attributed to the high stiffness and strength of the bacterial cellulose network. With this preform, renewable high performance hierarchical composites can also be manufactured by using conventional composite production methods, such as resin film infusion (RFI) or resin transfer molding (RTM). Here, we also describe the manufacturing of renewable hierarchical composites using double bag vacuum assisted resin infusion.

We present a novel method of manufacturing rigid and robust short natural fiber preforms using a papermaking process. Bacterial cellulose acts simultaneously as the binder for the loose fibers and provides rigidity to the fiber preforms. These preforms can be infused with a resin to produce truly green hierarchical composites.

صناعة قوية التشكيل الاستفادة من الألياف الطبيعية السليلوز البكتيرية كما بيندر

A novel method of manufacturing rigid and robust natural fiber preforms is presented here. This method is based on a papermaking process, whereby loose ...

Microbiologically Induced Calcite Precipitation Mediated by Sporosarcina pasteurii

The particular bacterium under investigation here (S. pasteurii) is unique in its ability, under the right conditions, to induce the hydrolysis of urea (ureolysis) in naturally occurring environments through secretion of an enzyme urease. This process of ureolysis, through a chain of chemical reactions, leads to the formation of calcium carbonate precipitates. This is known as Microbiologically Induced Calcite Precipitation (MICP). The proper culture protocols for MICP are detailed here. Finally, visualization experiments under different modes of microscopy were performed to understand various aspects of the precipitation process. Techniques like optical microscopy, Scanning Electron Microscopy (SEM) and X-Ray Photo-electron Spectroscopy (XPS)&#160;were employed to chemically characterize the end-product. Further, the ability of these precipitates to clog pores inside a natural porous medium was demonstrated through a qualitative experiment where sponge bars were used to mimic a pore-network with a range of length scales. A sponge bar dipped in the culture medium containing the bacterial cells hardens due to the clogging of its pores resulting from the continuous process of chemical precipitation. This hardened sponge bar exhibits superior strength when compared to a control sponge bar which becomes compressed and squeezed under the action of an applied external load, while the hardened bar is able to support the same weight with little deformation.

Microbiologically Induced Calcite Precipitation Mediated by Sporosarcina pasteurii

Protocols for microbiologically induced calcite precipitation (MICP) using the bacterium Sporosarcina pasteurii are presented here. The precipitated calcium carbonate was characterized through optical microscopy and scanning electron microscopy (SEM). It is also shown that exposure to MICP increases the compressive strength of sponge.

المستحثة الميكروبيولوجية الكالسيت الهطول وساطة من قبل<em&gt; Sporosarcina pasteurii</em

The particular bacterium under investigation here (S. pasteurii) is unique in its ability, under the right conditions, to induce the hydrolysis of urea ...

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and trade one defect for another. Tissue engineering holds the promise to address this increasing demand. However, most tissue engineering strategies fail to generate stable and functional tissue substitutes because of poor vascularization. This paper focuses on an in vivo tissue engineering chamber model of intrinsic vascularization where a perfused artery and a vein either as an arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration is directed inside a protected hollow chamber. In this chamber-based system angiogenic sprouting occurs from the arteriovenous vessels and this system attracts ischemic and inflammatory driven endogenous cell migration which gradually fills the chamber space with fibro-vascular tissue. Exogenous cell/matrix implantation at the time of chamber construction enhances cell survival and determines specificity of the engineered tissues which develop. Our studies have shown that this chamber model can successfully generate different tissues such as fat, cardiac muscle, liver and others. However, modifications and refinements are required to ensure target tissue formation is consistent and reproducible. This article describes a standardized protocol for the fabrication of two different vascularized tissue engineering chamber models in vivo.

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

This is a guideline for constructing in vivo vascularized tissue using a microsurgical arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration inside a tissue engineering chamber. The vascularized tissues generated can be employed for organ regeneration and replacement of tissue defects, as well as for drug testing and disease modeling.

هندسة الأنسجة عن طريق الجوهرية الأوعية الدموية في<em&gt; في فيفو</em&gt; غرفة هندسة الأنسجة

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and ...

Microfluidic Buffer Exchange for Interference-free Micro/Nanoparticle Cell Engineering

Engineering cells with active-ingredient-loaded micro/nanoparticles (NPs) is becoming an increasingly popular method to enhance native therapeutic properties, enable bio imaging and control cell phenotype. A critical yet inadequately addressed issue is the significant number of particles that remain unbound after cell labeling which cannot be readily removed by conventional centrifugation. This leads to an increase in bio imaging background noise and can impart transformative effects onto neighboring non-target cells. In this protocol, we present an inertial microfluidics-based buffer exchange strategy termed as Dean Flow Fractionation (DFF) to efficiently separate labeled cells from free NPs in a high throughput manner. The developed spiral microdevice facilitates continuous collection (&#62;90% cell recovery) of purified cells (THP-1 and MSCs) suspended in new buffer solution, while achieving &#62;95% depletion of unbound fluorescent dye or dye-loaded NPs (silica or PLGA). This single-step, size-based cell purification strategy enables high cell processing throughput (106 cells/min) and is highly useful for large-volume cell purification of micro/nanoparticle engineered cells to achieve interference-free clinical application.

This protocol describes the use of an inertial microfluidics-based buffer exchange strategy to purify micro/nanoparticle engineered cells with efficient depletion of unbound particles.

ميكروفلويديك تبادل العازلة لمايكرو / الجسيمات النانوية هندسة الخلايا خالية من التدخل

Engineering cells with active-ingredient-loaded micro/nanoparticles (NPs) is becoming an increasingly popular method to enhance native therapeutic ...

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In particular, light-mediated click reactions, such as photoinitiated thiol&#8722;ene and thiol&#8722;yne reactions, afford spatiotemporal control over material properties and allow the design of systems with a high degree of user-directed property control. Fabrication and modification of hydrogel-based biomaterials using the precision afforded by light and the versatility offered by these thiol&#8722;X photoclick chemistries are of growing interest, particularly for the culture of cells within well-defined, biomimetic microenvironments. Here, we describe methods for the photoencapsulation of cells and subsequent photopatterning of biochemical cues within hydrogel matrices using versatile and modular building blocks polymerized by a thiol&#8722;ene photoclick reaction. Specifically, an approach is presented for constructing hydrogels from allyloxycarbonyl (Alloc)-functionalized peptide crosslinks and pendant peptide moieties and thiol-functionalized poly(ethylene glycol) (PEG) that rapidly polymerize in the presence of lithium acylphosphinate photoinitiator and cytocompatible doses of long wavelength ultraviolet (UV) light. Facile techniques to visualize photopatterning and quantify the concentration of peptides added are described. Additionally, methods are established for encapsulating cells, specifically human mesenchymal stem cells, and determining their viability and activity. While the formation and initial patterning of thiol-alloc hydrogels are shown here, these techniques broadly may be applied to a number of other light and radical-initiated material systems (e.g., thiol-norbornene, thiol-acrylate) to generate patterned substrates.

We describe a sequential process for light-mediated formation and subsequent biochemical patterning of synthetic hydrogel matrices for three-dimensional cell culture applications. The construction and modification of hydrogels with cytocompatible photoclick chemistry is demonstrated. Additionally, facile techniques to quantify and observe patterns and determine cell viability within these hydrogels are presented.

تشكيل الضوء بوساطة والزخرفة من الهلاميات المائية للتطبيقات خلية ثقافة

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...