Gostaríamos de agradecer NIH para bolsas de financiamento R01-AI026328 (KAK) e R01-AI079004 (KAK).

1. A remoção do tracto genital <ol><li> Euthanize o mouse utilizando as diretrizes aprovadas. Fazer incisão na linha baixa e retrair a pele. </li><li> Isolar e remover trato genital todo, do oviduto da abertura vaginal. </li><li> Abrir todo o trato longitudinalmente com uma tesoura. </li><li> Cortar o tracto genital com finas tesouras cirúrgicas em pequenos pedaços (cerca de &lt;1 mm) numa placa de Petri com RPMI-10/EDTA completo (ver a fórmula seguinte) e agita-se o frasco de tecido em 125 ml à temperatura ambiente num agitador magnético definido para 15 min. Este procedimento é repetido duas vezes e, em seguida, o sobrenadante, que contém o epitélio e outros detritos, é descartada. </li><li> Despeje conteúdo do balão através de um filtro celular (40μm). Lavar resíduo EDTA com meio completo. RPMI/10 completo: RPMI 500 ml (Gibco), 10% de soro fetal bovino (FBS), inactivado pelo calor, 5 ml penicilina / estreptomicina, a 5 ml de HEPES 1M. RPMI-10/EDTA completo: RPMI a 10% (como acima) com E 5mMDTA </li></ol> 2. Digerir tecidos do trato genital <ol><li> Transferir pedaços de tecido para um frasco novo, com 20 ml RPMI-10/collagenase fresco (ver receita abaixo) e digerir o tecido, a 37 ° C durante 1 hora num agitador magnético definido para agitar vigorosamente o tecido. RPMI-10/collagenase completo: Pouco antes de utilização, reconstituir colagenase tipo VIII (Sigma; armazenar a -20 ° C, ou de acordo com as instruções do fabricante.), Adicionar em RPMI/10 completo até uma concentração final de 450-500U/ml. </li><li> Após a digestão em primeiro lugar, recolher os sobrenadantes através de 100 células coador um, manter as células em gelo. </li><li> Transferir o tecido não digerido para um novo frasco e repetir a etapa 2.1 por mais duas vezes, utilizando RPMI-10/collagenase completo fresco para um total de três digestões separadas. Neste ponto, há pedaços de tecido visível deve estar em solução. </li><li> Piscina os sobrenadantes todos juntos a partir de uma amostra e recolher a 100 filtro célula iM. Gire a cElls para baixo. Os sedimentos celulares irão ser separados usando gradientes de Percoll. </li></ol> 3. Separação de células do tracto genital, utilizando gradientes de Percoll <ol><li> Preparar cada concentração de Percoll antes do uso: <ul><li> 100% de Percoll isotônica: mix 09:01 estoque Percoll (Pharmacia Biotch) vs PBS 10x. pH a 7,4 com HCL. </li><li> Solução de Percoll a 40%: misturar 40 mL de Percoll isotónico 100% e 60 ml de meio RPMI completo. </li><li> Solução de Percoll a 70%: misturar 70 mL de Percoll isotónico 100%, com 30 ml de meio RPMI completo. </li></ul></li><li> Ressuspender cada pelete de células a partir do passo 6 em soluções de Percoll 40%. Um volume igual de Percoll a 70% irá ser utilizado para fazer os gradientes. Há duas maneiras de configurar tubos de gradiente: <ol><li> Sob-camada: adicionar a suspensão de células com 40% de Percoll em um tubo de gradiente em primeiro lugar, em seguida, cuidadosamente sob-camada de Percoll 70%. </li><li> Ao longo da camada de: adicionar Percoll a 70% num tubo de um lado, em seguida lenta e cuidadosamente carregar Percoll a 40%, contendo as células nasuperior. </li></ol></li><li> Amostras de gradiente vai ser centrifugadas a 900 xg à temperatura ambiente, durante 20 minutos com o freio. </li><li> Os linfócitos será na camada de interface entre 40% e 70% de camadas Percoll. Cuidadosamente colher a camada de interface, lave com RPMI 1:3 e girar a 740 xg. Os linfócitos será no sedimento de células e estão prontos para utilização posterior. </li></ol> 4. Resultados representativos Um exemplo de isolamento de linfócitos a partir do tracto genital rato e análise de citometria de fluxo (FACS) é mostrado na Figura 1. Tracto genital foi removido de Chlamydia muridarum intravaginalmente rato infectado 7 dias após a infecção. Duas vias genitais foram agrupados em conjunto de modo a ter um número suficiente de linfócitos exame funcional e fenotípica por FACS. Tecidos dissecados foram processados ​​pela digestão e passos de isolamento como descrito acima. A suspensão de células isoladas foram corados com vários conjugados com fluorocromosOs anticorpos monoclonais contra CD3 de ratinho, células T CD4 e CD8. A Figura 1 mostra uma apresentação dot-plot de CD4 células T positivas contra as células T CD8 positivas gated em linfócitos T CD3 positivas. Nosso procedimento pode examinar linfócitos isolados do trato genital de modelos de doenças diferentes para avaliar várias características de células imunes funcionais e fenotípica em diferentes doenças no modelo do rato. Estes incluem diversas células imunes, tais como células dendríticas, neutrófilos, macrófagos NK, NKT, células T (células T específicas Ag), células B, etc 3-10. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4391/4391fig1.jpg" /> Linfócitos Figura 1. Foram isolados a partir de trato genital de camundongos infectados com Chlamydia muridarum, utilizando o método aqui apresentado. Após o processo de separação completa, os linfócitos foram coradas com fluorocromo-conjugados CD3, CD4 e CD8. Os dados foram quadrante fechado em linfócitos CD3 +,mostrando CD4 + versus CD8 + com e porcentagem de células fechadas.

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	<li>M, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+perinatal+immune+development+on+mucosal+homeostasis+and+chronic+inflammation.">The impact of perinatal immune development on mucosal homeostasis and chronic inflammation.</a> Nat. Rev Immunol. 12, 9-23 (2011).</li><li>Centers for Disease Control and Prevention. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> 2010 Sexually Transmitted Diseases Surveillance. , (2010).</li><li>Jain, S., Patrick, A. J., Rosenthal, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+tandem+copies+of+conserved+gp41+epitopes+incorporated+in+gag+virus-like+particles+elicit+systemic+and+mucosal+antibodies+in+an+optimized+heterologous+vector+delivery+regimen.">Multiple tandem copies of conserved gp41 epitopes incorporated in gag virus-like particles elicit systemic and mucosal antibodies in an optimized heterologous vector delivery regimen.</a> Vaccine. 28, 7070-7080 (2010).</li><li>Tang, V. A., Rosenthal, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravaginal+infection+with+herpes+simplex+virus+type-2+(HSV-2)+generates+a+functional+effector+memory+T+cell+population+that+persists+in+the+murine+genital+tract.">Intravaginal infection with herpes simplex virus type-2 (HSV-2) generates a functional effector memory T cell population that persists in the murine genital tract.</a> J. Reprod. Immunol. 87, 39-44 (2010).</li><li>Gillgrass, A. E., Tang, V. A., Towarnicki, K. M., Rosenthal, K. L., Kaushic, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+against+genital+herpes+infection+in+mice+immunized+under+different+hormonal+conditions+correlates+with+induction+of+vagina-associated+lymphoid+tissue.">Protection against genital herpes infection in mice immunized under different hormonal conditions correlates with induction of vagina-associated lymphoid tissue.</a> J. Virol. 79, 3117-3126 (2005).</li><li>Sajic, D., Patrick, A. J., Rosenthal, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+delivery+of+CpG+oligodeoxynucleotides+expands+functional+dendritic+cells+and+macrophages+in+the+vagina.">Mucosal delivery of CpG oligodeoxynucleotides expands functional dendritic cells and macrophages in the vagina.</a> Immunology. 114, 213-224 (2005).</li><li>Jiang, J. Q., Patrick, A., Moss, R. B., Rosenthal, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8++T-cell-mediated+cross-clade+protection+in+the+genital+tract+following+intranasal+immunization+with+inactivated+human+immunodeficiency+virus+antigen+plus+CpG+oligodeoxynucleotides.">CD8+ T-cell-mediated cross-clade protection in the genital tract following intranasal immunization with inactivated human immunodeficiency virus antigen plus CpG oligodeoxynucleotides.</a> J. Virol. 79, 393-400 (2005).</li><li>Gill, N., Chenoweth, M. J., Verdu, E. F., Ashkar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NK+cells+require+type+I+IFN+receptor+for+antiviral+responses+during+genital+HSV-2+infection.">NK cells require type I IFN receptor for antiviral responses during genital HSV-2 infection.</a> Cell Immunol. 269, 29-37 (2011).</li><li>Thatte, A., DeWitte-Orr, S. J., Lichty, B., Mossman, K. L., Ashkar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+role+for+IL-15+in+TLR-mediated+innate+antiviral+immunity+against+genital+HSV-2+infection.">A critical role for IL-15 in TLR-mediated innate antiviral immunity against genital HSV-2 infection.</a> Immunol. Cell Biol. 89, 663-669 (2011).</li><li>Kwant-Mitchell, A., Ashkar, A. A., Rosenthal, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+innate+and+adaptive+immune+responses+against+herpes+simplex+virus+type+2+in+a+humanized+mouse+model.">Mucosal innate and adaptive immune responses against herpes simplex virus type 2 in a humanized mouse model.</a> J. Virol. 83, 10664-10676 (2009).</li><li>Gallichan, W. S., Rosenthal, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+the+estrous+cycle+on+local+humoral+immune+responses+and+protection+of+intranasally+immunized+female+nice+against+herpes+simplex+virus+type+2+infection+in+the+genital+tract.">Effects of the estrous cycle on local humoral immune responses and protection of intranasally immunized female nice against herpes simplex virus type 2 infection in the genital tract.</a> Virology. , 224-487 (1996).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Neste protocolo, é mostrado como preparar linfócitos no trato genital de mouse e é facilmente dominado. O ponto mais crítico deste processo é o de manter a viabilidade das células, mantendo as células em gelo. O rendimento de células a partir deste método depende da técnica, a manipulação de habilidade, o estado infeccioso do rato (ou ingénuo dia após a infecção), o agente patogénico (bacterianas, virais, fúngicas) e da secção do tracto reprodutivo murino examinados (oviduto, útero, segmento vaginal...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td></td></tr><tr><td> Colagenase </td><td> Sigma Ciências da Vida </td><td> C2139-1G </td><td></td></tr><tr><td> Percoll </td><td> GE Healthcare Bio-Sciences </td><td> 17-0891-01 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI1640 </td><td> Gibco pela Life Technologies </td><td> 11875 </td><td></td></tr></tbody></table>

isolation of lymphocytes from mouse genital tract mucosa

Superfícies mucosas, inclusive no trato gastrointestinal, urogenital e respiratória, fornecer portas de entrada para patógenos, como vírus e bactérias 1. Mucosas são também locais indutivos no hospedeiro para gerar a imunidade contra os agentes patogénicos, tais como as manchas Peyers no tracto intestinal e do tecido nasal associada linforreticular no trato respiratório. Esta característica única traz a imunidade da mucosa como um jogador crucial do sistema de defesa do hospedeiro. Muitos estudos têm sido focados na gastrointestinais e respiratórias mucosas. No entanto, tem havido pouca investigação de reprodução mucosas. A mucosa do trato genital é o local da infecção primária de doenças sexualmente transmissíveis (DST), incluindo infecções bacterianas e virais. DSTs são um dos maiores desafios de saúde mais críticos que o mundo enfrenta hoje. Centros para Controle e Prevenção de Doenças estima que existem 19 milhões de novos a cada ano infecciosas nos Estados Unidos. STDs custar os EUA sistema de saúde 17000000000 dólares a cada ano 2, e indivíduos de custos ainda mais em conseqüências imediatas e de saúde ao longo da vida. Para enfrentar este desafio, uma maior compreensão da imunidade da mucosa reprodutiva é necessária e isolar linfócitos é um componente essencial destes estudos. Aqui, apresentamos um método para isolar reproduzível linfócitos de murinos trato genital feminino para estudos imunológicos que podem ser modificados para adaptação a outras espécies. O método descrito a seguir é baseado em um rato.

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Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

Uma maneira eficiente de isolar linfócitos a partir do tracto genital rato é descrito. Este método tira vantagem da digestão enzimática e separação por gradiente de Percoll para permitir o isolamento eficaz. Esta técnica é também adaptável para utilização em espécies de outros

O isolamento de linfócitos de rato Genital Tract Mucosa

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

14.2K visualizações.  University of California, Los Angeles. Uma maneira eficiente de isolar linfócitos a partir do tracto genital rato é descrito. Este método tira vantagem da digestão enzimática e separação por gradiente de Percoll para permitir o isolamento eficaz. Esta técnica é também adaptável para utilização em espécies de outros