1。脑线粒体隔离（ 改编自布朗MR等。9） <ol><li>牺牲大鼠批准的机构动物护理和使用委员会（IACUC）的使用方法。 </li><li>切头斩首的动物，切开皮肤，暴露颅骨。 </li><li>轻轻地打开颅骨切割用剪刀或咬骨钳。取出大脑。 </li><li>百果精细小脑脑无隔离缓冲（ 见表1），并将其转移到5毫升的玻璃/聚四氟乙烯匀浆器（设备列表）。 </li><li>轻轻均质组织10次（无气泡），约5分钟。 </li><li>在1500×g离心样品10分钟，在4°C在台式离心机。 </li><li> （线粒体和突触体）保存上清，弃沉淀（核材料和细胞碎片）。在16,000×g离心10分钟，在4°C，在台式离心机。 </li><li>丢弃上清，重新悬浮颗粒在500微升的隔离缓冲。破坏与细胞破坏容器（设备列表）突触。施加压力为1,200 psi 10分钟，随后迅速减压。 </li><li>到聚蔗糖梯度层的混合物（ 见表2），SW-50.1转子和离心的地方126,500×g为20分钟，在4°C在超速离心机（设备列表）。沉淀纯化的线粒体中，层之间的不同密度的聚蔗糖是不间断的突触体。 </li><li>洗净颗粒隔离缓冲离心16,000×g为10分钟，在4°C在台式离心机。 </li></ol> 2。 Submitochondrial囊泡（SMV）隔离（改编自陈等10） <ol><li>重悬在200μl结合，用等体积的1％毛地黄皂苷的隔离缓冲线粒体允许坐在在冰上放置15分钟。 </li><li>添加更多的隔离浅黄色er和离心机在16000×g为10分钟，在4°C在台式离心机。两次做到这一点。 </li><li>重新悬浮颗粒在200微升隔离缓冲和10％芦布若尔PX（C12E​​9）加入2μl。混合，并允许坐在冰上15分钟。 </li><li>层混合物加入到隔离缓冲，在SW-50.1转子和离心机在182,000×g在4℃1小时。 </li><li>洗净最终沉淀在台式离心机隔离缓冲16,000×G离心10分钟，在4°C </li></ol> 3。电生理记录<ol><li>一个典型的的电生理钻机包括一个放大器，一个Digidata 1440A的模拟 - 数字转换器接口，在与操纵器软件pClamp10.0，显微镜，振动隔离表，法拉第笼配备一台PC电脑。 </li><li>硼硅玻璃毛细管插入火焰/褐色微管拖轮型号P-87。吸管拉马程序进行了优化，产生与80〜100MΩ的电阻之间的吸液管。 </li><li> SMVS被放置在细胞内的生理溶液（在录制过程中在适当的时间被添加ATP）（ 表3）。膜片钳移液器都充满了相同的解决方案（ATP）。的记录，则通过形成千兆欧姆SMVS密封件置于在室温下。尼康或蔡司倒置显微镜相衬显微镜囊泡的可视化。 </li><li>膜电位保持在电压范围从-100 mV +100 mV为10秒的期间。录音被过滤在5 kHz使用放大器电路。杂散电或非特异性噪声小于1 PA水平是可取的成功记录。 </li><li>与的10.0 Clampfit软件例如，以确定的频率和幅度的单信道事件数据进行分析。电压依赖性决定绘制电流电压关系。 </li></ol>

<ol>
	<li>Cheng, W. C., Berman, S. B., Ivanovska, I., Jonas, E. A., Lee, S. J., Chen, Y., Kaczmarek, L. K., Pineda, F., Hardwick, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+factors+with+dual+roles+in+death+and+survival.">Mitochondrial factors with dual roles in death and survival.</a> Oncogene. 25, 4697-4705 (2006).</li><li>Duchen, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+and+calcium+in+health+and+disease.">Mitochondria and calcium in health and disease.</a> Cell Calcium. 44, 1-5 (2008).</li><li>Lemasters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+mitochondrial+membrane+permeability+in+pathogenesis,+autophagy+and+control+of+metabolism.">Modulation of mitochondrial membrane permeability in pathogenesis, autophagy and control of metabolism.</a> J. Gastroenterol. Hepatol. 22, S31-S37 (2007).</li><li>Cox, G. B., Jans, D. A., Fimmel, A. L., Gibson, F., Hatch, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypothesis.+The+mechanism+of+ATP+synthase.+Conformational+change+by+rotation+of+the+beta-subunit.">Hypothesis. The mechanism of ATP synthase. Conformational change by rotation of the beta-subunit.</a> Biochim. Biophys. Acta. 768, 201-208 (1984).</li><li>Cox, G. B., Fimmel, A. L., Gibson, F., Hatch, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+ATP+synthase:+a+reassessment+of+the+functions+of+the+b+and+a+subunits.">The mechanism of ATP synthase: a reassessment of the functions of the b and a subunits.</a> Biochim. Biophys. Acta. 849, 62-69 (1986).</li><li>Cory, S., Huang, D. C., Adams, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Bcl-2+family:+roles+in+cell+survival+and+oncogenesis.">The Bcl-2 family: roles in cell survival and oncogenesis.</a> Oncogene. 22, 8590-8607 (2003).</li><li>Vander Heiden, M. G., Thompson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bcl-2+proteins:+regulators+of+apoptosis+or+of+mitochondrial+homeostasis.">Bcl-2 proteins: regulators of apoptosis or of mitochondrial homeostasis.</a> Nat. Cell Biol. 1, 209-216 (1999).</li><li>Alavian, K. N., Li, H., Collis, L., Bonanni, L., Zeng, L., Sacchetti, S., Lazrove, E., Nabili, P., Flaherty, B., Graham, M., Chen, Y., Messerli, S. M., Mariggio, M. A., Rahner, C., McNay, E., Shore, G. C., Smith, P. J. S., Hardwick, J. M., Jonas, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bcl-xL+regulates+metabolic+efficiency+of+neurons+through+interaction+with+the+mitochondrial+F1FO+ATP+synthase.">Bcl-xL regulates metabolic efficiency of neurons through interaction with the mitochondrial F1FO ATP synthase.</a> Nat. Cell Biol. 13 (10), 1224-1233 (2011).</li><li>Brown, M. R., Sullivan, P. G., Dorenbos, K. A., Modafferi, E. A., Geddes, J. W., Steward, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitrogen+disruption+of+synaptoneurosomes:+an+alternative+method+to+isolate+brain+mitochondria.">Nitrogen disruption of synaptoneurosomes: an alternative method to isolate brain mitochondria.</a> Journal of Neuroscience Methods. 137, 299-303 (2004).</li><li>Chan, T. L., Greenawalt, J. W., Pedersen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+ultrastructural+properties+of+a+mitochondrial+inner+membrane+fraction+deficient+in+outer+membrane+and+matrix+activities.">Biochemical and ultrastructural properties of a mitochondrial inner membrane fraction deficient in outer membrane and matrix activities.</a> J. Cell Biol. 45 (2), 291-305 (1970).</li><li>Young, H. K. o., Delannoy, M., Hullihen, J., Chiu, W., Pedersen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+ATP+Synthasomes.">Mitochondrial ATP Synthasomes.</a> J. Biol. Chem. 278 (14), 12305-12309 (2003).</li></ol>

没有利益冲突的声明。

描述的方法，本文纯线粒体使隔离结束时，步骤1和步骤的submitochondrial囊泡（SMVS）在步骤2之后从全脑的细胞此方法phenotypes.SMVspurified的没有区别，基本上不含污染的其它亚细胞器所示图1和我们以前的工作（Alavian KN 等 。8），并保留其结构和功能的完整性，在冷冻之前。冻融后，分离线粒体或SMVS用于录音和生化检测，但没有呼吸的研究。 此外，此?...

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name </td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Potter-Elvehjem Tissue Grinder withPTFEPestle</td>
 <td>Krackeler Scientific, Inc.</td>
 <td>1-7725T-5 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Eppendorf Centrifuge 5424 </td>
 <td>Eppendorf </td>
 <td>5424 000.410</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>4639 Cell Disruption Vessel</td>
 <td>Parr Instrument Company</td>
 <td>4639</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ficoll</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>F5415</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Polycarbonate centrifuge tubes</td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td>P20314</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SW-50.1 rotor </td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>L8-70M Ultracentrifuge</td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Digitonin</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>D5628 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Lubrol PX (C12E9) </td>
 <td>Calbiochem</td>
 <td>205534</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Axopatch 200B </td>
 <td>Axon Instruments </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Digidata 1440A </td>
 <td>Molecular Device</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>pClamp10.0</td>
 <td>Molecular Device</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Manipulator</td>
 <td>Sutter Instrument</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Borosilicate glass capillary</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>1308325</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Flaming/Brown Micropipette Puller Model P-87</td>
 <td>Sutter Instrument</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

f1fo atpase vesicle preparation and technique for performing patch clamp recordings of submitochondrial vesicle membranes

线粒体都参与许多重要的细胞功能，包括新陈代谢，生存，发展和钙信号2。的两个最重要的线粒体功能相关的高效生产的ATP，通过氧化磷酸化作用，细胞的能量货币，以及调解的程序性细胞死亡的信号3。 主要负责产生ATP的酶F1FO ATP合成酶，也称为ATP合酶4-5。近年来，线粒体的凋亡细胞和坏死细胞死亡的作用已经受到人们的关注。细胞凋亡，如Bax的BCL-2家族蛋白进入线粒体外膜，低聚和通透的外膜，促凋亡因子释放到细胞质6。在经典的坏死性细胞死亡中，例如，所产生的局部缺血或神经元的兴奋性毒性，LARGE，监管不力，在基体中的钙有助于增加内膜毛孔，线粒体通透性转换孔或mPTP的开放。此去极化内膜，促进外膜破裂，释放促凋亡因子和代谢功能紊乱，导致渗透压的变化。许多蛋白质，包括了Bcl-xL 7与F1FO ATP合成酶，调节其功能。 Bcl-xL的直接交互的F1FO ATP合酶β亚基，这种相互作用降低泄漏电导在F1FOATPasecomplex内的，增加的H +净运输期间F1FO F1FO ATPase活性8，从而增加线粒体效率。要研究ATP合成酶的活性和调制，我们孤立从啮齿动物脑submitochondrial囊泡（SMVS）含有F1FO ATP酶的。 SMVS保留F1FO ATP酶的结构和功能完整性所示在Alavian 等 。在这里，我们描述了一种方法，我们已经成功地用于隔离SMVS大鼠脑和我们划定膜片钳技术分析通道活性（离子泄漏电导）SMVS。

我们的协议的第一步骤中可以分离纯化的线粒体，如在图1中所示的Western印迹。在图2中示出一个脑源性submitochondrial的囊泡补丁记录的一个例子。使用内而外的补丁配置，我们展示了调制由ATP通道的活性。控制（CTL）录音（左）显示多导通道活动的平均电导为600 PS的峰值。立刻被减少后1毫米ATP洗澡。三磷酸腺苷的整体效果是SMVS的补丁以浓度依赖的方式减少的电导。要测量...

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F1FO ATPase Vesicle Preparation and Technique for Performing Patch Clamp Recordings of Submitochondrial Vesicle Membranes

一种方法隔离submitochondrial的富集大鼠脑F1FO ATP合酶复合囊泡。这些囊泡允许F1FO ATP酶的活性配合物及其调制使用膜片钳记录技术的研究。

<sub&gt; 1</sub&gt; F<sub&gt; O</subATP酶微囊的制备和表演膜片钳记录的Submitochondrial泡膜技术

Mitochondria are involved in many important cellular  functions including metabolism, survival1, development and, calcium signaling2. Two of the most ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

F1FO ATPase Vesicle Preparation and Technique for Performing Patch Clamp Recordings of Submitochondrial Vesicle Membranes

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