萌芽酵母酿酒酵母中软骨蛋白定位的评估

该协议旨在确定酵母线粒体蛋白的递交软骨定位，这被认为是线粒体蛋白功能阐明过程中的基本步骤。该协议适用于我们在不同生长条件下维持的酵母菌株。代表研究线粒体的强大研究工具。

首先，将甘油储备中的条纹细胞储存在80°C下，放到YPD琼脂平板上，以从感兴趣的菌株中分离出单个菌落。并将板在30°C下孵育2至3天。通过将YPD琼脂平板中的2至3个单个菌落接种在含有10至30mlYPGal培养基的100ml锥形瓶中来制备发酵剂培养物。

将烧瓶在30°C下孵育24小时，以180至200rpm的剧烈振荡。将发酵剂稀释到1 L新鲜YPGal培养基中，在600nm处的光密度小于0.1。在30°C下培养细胞，以180至200rpm剧烈振荡约12小时，直到光密度达到1至1.5。

如文中所述，执行高度纯化的线粒体的分离。并按照制造商的说明，使用Bradford测定法测定高度纯化的线粒体制剂的蛋白质浓度。用冰冷的SEM缓冲液将蛋白质浓度调节至10mg / ml。

将40升高度纯化的线粒体转移到四个1.5ml预冷和标记的微量离心管中。在第一管和第二管中加入360 l的SEM缓冲液。并在第三和第四管中加入360升EM缓冲液。

使用移液方案，根据文本，在第二管和第四管中加入4L新鲜制备的蛋白酶K。轻轻混合所有试管后，在冰上孵育30分钟，偶尔混合。为了停止蛋白酶K活性，向所有四个管中加入4 L 200 mM PMSF。

在4 C下以20， 000×g离心管30分钟，并在不干扰沉淀的情况下将上清液收集到新的1.5ml预冷标记微量离心管中。接下来，将沉淀重悬于400升冰冷的SEM缓冲液中。为了灭活可能的微量蛋白酶K，沉淀收集的上清液并用三氯乙酸重悬沉淀至终浓度为10%将管在冰上孵育10分钟。

将三氯乙酸处理过的样品在4 C下以12， 000×g离心10分钟，并在除去上清液后，将沉淀重悬于200l样品缓冲液中。如果溴酚蓝变黄，加入1至5升1 M Tris基底，直至变蓝。向所有离心管中加入4升200 mM PMSF。

将样品储存在80°C，直到通过SDS-PAGE和蛋白质印迹进一步分析。将200升高度纯化的线粒体转移到1.5ml预冷的微量离心管中。用冰冷的SEM缓冲液将线粒体稀释一倍。

使用与小体积兼容的超声仪，在冰上超声处理线粒体3次，持续30秒。将样品在4 C下以100， 000×g离心30分钟，并将上清液收集在新的1.5ml预冷微量离心管中。将管标记为S"用于可溶性蛋白质部分后，将管保持在冰上。

将上一步中的沉淀重悬于400升冰冷的SEM缓冲液中。将100l重悬沉淀转移到新的1.5ml预冷微量离心管中。将管子标记为SMP"，用于屈服粒体颗粒分数，并将管子保持在冰上。

用新鲜制备的200mM碳酸钠将剩余的300l重悬沉淀稀释一倍。并将稀释后的样品在冰上孵育30分钟。然后，在4 C下以100，000×g离心样品30分钟，将上清液收集到新的1.5ml预冷微量离心管中。

将样品标记为CS"以获得碳酸盐上清液部分，并将试管保持在冰上。将上一步中的沉淀重悬于400升冰冷的SEM缓冲液中。并将样品命名为CP"，用于碳酸盐沉淀馏分。

用三氯乙酸沉淀所有样品至终浓度为10%，并将试管在冰上孵育10分钟。然后，在4 C下以12， 000×g离心样品10分钟，除去上清液后，将每个沉淀重悬于样品缓冲液中。如果样品缓冲液变为黄色，则加入1至5升1 M Tris碱，直到变为蓝色。

向所有试管中加入1升200 mM PMSF，并储存在80°C，直到SDS-PAGE和蛋白质印迹进一步分析。在蔗糖密度梯度离心中纯化粗线粒体部分，并观察到其他细胞污染物的减少。线粒体到米托普斯特的转化通过沉淀中膜间空间蛋白细胞色素b2的消失来监测。

伴随上清液中的外观。由于渗透性休克破坏外膜，观察到蛋白酶K介导的膜间蛋白Sco1的降解。通过保护细胞色素b2和Sco1防止沉淀级分中的蛋白酶K降解，证实了线粒体膜的外层完整性。

类似地，基质可溶性蛋白KGD的保护证实了线粒体膜内部的完整性。Prx1蛋白质印迹图提示膜间空间和基质中的双线粒体定位。对线粒体进行超声处理和碳酸盐提取，以研究膜蛋白的拓扑结构。

整体膜蛋白浇注保留在颗粒组分中。在上清液级分中检测到KGD。颗粒中KGD蛋白的检测是由于超声处理参数变化影响了SMP的形成。

碳酸钠处理后，KGD和SMP级分被溶解并存在于上清液级分中。Prx1蛋白质印迹图提示与膜周边相关。为了提交软骨分馏方案的成功，重要的是通过向样品中添加PMSF来停止低渗肿胀后的蛋白酶K活性。

位点提供有关膜软骨蛋白定位的信息。该协议还可用于检查线粒体制剂的完整性，这是线粒体亚室蛋白质组学研究期间的基础。