格兰特支持，国家科学基金会，美国国立卫生研究院NIH CA165263 CA150197：NIH CA150197S1（HJ功夫），：NIH CA150197S1（CA Changou）PHY-0120999 中心生物光子学科学与技术 （DL欧胜，庄花园街），国防部PC073420（RJ大胆），研究挪威理事会，：儿子里夫埃埃里克森旅游格兰特209286/F11（BS阿鲁瓦莉）。 HJ功夫也承认奥本社区癌症基金的支持。 RJ大胆也承认J.麦当劳养老的支持。 我们感谢珍妮博士伟仁西贡博士和吴柏文DesigneRx慷慨供给ADI。

1。第1部分：细胞培养，免疫荧光标记<ol><li> CWR22 RV1人前列腺肿瘤细胞生长在盖玻片（＃1.5或170微米厚）置于6孔培养板中，含有10％胎牛血清（FBS）和1％青霉素/链霉素/谷氨酰胺的RPMI（敏达，VA）。 </li><li>引起细胞自噬与精氨酸脱亚胺酶（ADI，0.3微克/毫升）的磷酸盐缓冲盐水（PBS）处理选定的样品。 </li><li>固定细胞，用4％多聚甲醛（PFA，Fisher Scientific公司，NH）在PBS中稀释，将100μl每盖玻片，在RT下10分钟。 </li><li>用1毫升HBS / BSA洗涤细胞3次。 </li><li>通透细胞用0.05％皂甙（Sigma公司），HEPES（HBS）/ BSA，加入100μl每盖玻片，在RT下的15分钟。 </li><li>免疫标记，块样品与2.5％的酪蛋白（Sigma公司），每盖玻片100微升，HBS / BSA 1小时RT之前。 </li><li>孵育固定细胞主要抗体稀释在2.5％酪蛋白/ HBS / BSA，每coversl 100微升IP，O / N在4°C。 </li><li>用1毫升HBS / BSA洗涤细胞3次。 </li><li>固定细胞孵育二次抗体稀释在2.5％酪蛋白/ HBS / BSA，每100微升盖玻片，在室温下1小时。 </li><li>用1毫升HBS / BSA洗涤细胞3次。 </li><li> SlowFade金制备的盖玻片，在显微镜玻片安装或延长Gold抗淬灭试剂（Invitrogen，CA），含有4&#39;，6 - 二脒-2 - 苯基吲哚（DAPI）。 </li><li>指甲油密封盖玻片边缘。为了获得最佳的成像效果，让时间（理想的O / N）为防褪色媒体的彻底渗透细胞。 </li><li>清洁盖玻片的表面与甲醇和/或氯仿。 </li><li>浸油（折射率1.520成像时，在37°C或1.516成像时，在RT）60X 1.42 NA物镜（奥林巴斯，日本）。 </li><li>滑动感兴趣的细胞在显微镜舞台上，并建立重点。 </li></ol> 2。第2部分：准备细胞实时成像<ol><li>长大无缝线路22 RV1细胞表达绿色荧光蛋白偶联型轻链3（LC3-GFP）的RPMI培养基中，在35 mm的聚-D-赖氨酸涂覆的玻璃底培养皿（MatTek，MA）中含有10％FBS和1％抗生素。应接种于细胞足够的密度，方便快速扩散，但没有那么多细胞覆盖，成群成像时。 </li><li>治疗选择与ADI（0.3微克/毫升）的PBS的细胞样本。 </li><li>约1小时，在成像之前，稀释红色LysoTracker DND-99（Invitrogen公司，CA），用20毫升的RPMI 1.5微升。含有10％FBS和1％抗生素。使用的解决方案，包含ADI选定样本。预热到37°C前加入培养皿所有媒体。 </li><li>与红的RPMI含有LysoTracker的DND-99 15-45分钟，在37°C孵育</li><li>约30分钟，在成像之前，打开的WeatherStation环境围封，并允许平衡到37℃和5％CO 2的（humidif与IED的空气）。 </li><li>用PBS洗涤细胞，并与标准的RPMI只含有10％FBS和1％抗生素更换介质。 ADI表示样品。 </li><li>安装35毫米盖玻片底培养皿定制适配器（应用精密公司，WA），并在显微镜舞台上的位置。 60X 1.42 NA物镜用浸油（折射率1.520），并在舞台上的位置安装的培养皿。 </li></ol> 3。第3部分：反卷积显微镜和分析该协议在本节中假定DeltaVision的个人DV卷积显微镜和相关的应用程序套件（应用精密公司，WA）SoftWorX使用。 <ol><li>打开显微镜系统，包括采集工作站和仪器控制器。打开Resolve3D应用初始化显微镜阶段，并开启氙灯光源。允许光源的热身和达到稳定的条件下为10分钟。 </li><li>添加滴浸油（折射率1.520活样品在37℃或固定的样品在RT 1.516）60X 1.42 NA物镜，在物镜的中心滑动试样（盖玻片正面朝下）。 </li><li>无论是使用明视场或外部照明和粗调调节旋钮，慢慢地提高胎圈浸油物镜，直到与倒置的玻璃盖接触。 （从这点来说，应该成为焦点的细胞层内几圈微调对焦调节旋钮）。当使用固定的样品在幻灯片上，它被建议，以避免细胞内或附近有气泡的任何领域。当观看直播样品上的玻璃底菜，避免移动物镜玻璃盖玻片的边界之外。 </li><li>自噬体可以识别eGFP的信号（绿色）。溶酶体确定由LysoTracker红（现场采样）或反灯泡1荧光抗体（固定样本）。细胞的细胞核用DAPI圣发现癌宁（固定样本）。 </li><li>选择理想的视野。理想的情况下，细胞应具有良好的荧光信号在所有适当的渠道，并充分地附着盖玻片表面上摊开，使细胞内的内容是很容易想象的。侧的x，y和z聚焦在小的调整，可以控制由计算机使用Acquire3D接口。设置分级1X1或2x2的，这取决于所需的视场（更多的细胞中可以看出分级设置为2x2的领域）。 </li><li>对于一个给定的图像通过一个电池的中部，设置最大像素强度不超过3000个计数的曝光参数（ 例如 ％的发送功率和曝光时间）。一般情况下，％透光率应尽可能低的设置，相应的曝光时间在1秒内没有提高。重复此过程，每个荧光色进行成像，并为每个单独的视野，以获得最高质量的图像。 </li><li>设置在u稍稍调整焦点分别在顶部和底部的细胞样品，Z堆栈PPER和下限。 Z堆栈中的图像的总数，从而来确定这些限制和层与层之间的间距（默认值：0.2微米）。 </li><li>为了最大限度地减少运动伪影，图像采集过程中，我们建议设置图像“波长，那么Z-Stack的”用于固定试样，“Z-Stack的波长”现场样品采集模式。 </li><li>荧光图像反褶积使用SoftWorX（应用精密，WA）以后分析使用VoloCITY（即兴，现在上Perkin Elmer公司，MA）。 </li></ol> 4。第4部分：超高分辨率，结构照明显微镜（OMX） 本节中的协议适用于使用结构照明显微镜OMX（应用精密，WA）。 <ol><li>接通主电源和所需的激光器（410纳米，488纳米，和/或532纳米）。等待20英里n为激光热稳定。 </li><li>浸油（用于固定试样在室温下的折射率1.516）60X 1.42 NA物镜。如果气泡出现在油滴，清洁的目的，并再次添加机油。 </li><li>如将样品幻灯片的舞台上，并在必要时，允许10分钟的细胞在盖玻片上定居。 </li><li>初始化收购方案。使用荧光照明，直到锋利的细胞轮廓可以看出，调整的重点。 （在任何时候都应该小心，以尽量减少暴露的细胞荧光激发，直到实际图像采集）。 </li><li>螺旋拼接扫描可以获取的样品预览较大的地区，选择单元格或地区的利益。建议使用短的曝光时间（1-10毫秒），低激磁功率（0.1-1％传输），同时扫描样品或寻找目标。 </li><li> GFP-LC3荧光识别自噬。识别溶酶体的Alexa Fluor 555抗LAMP（溶酶体相关膜蛋白）和细胞核用DAPI（固定的样品）。 </li><li>选择的实验条件，包括激发波长，图像区域（ 例如，512×512），堆栈的厚度，曝光时间，激光透射百分率。对于超分辨图像，确保结构照明选项启用。在OMX卷积显微镜，选择传统的照明选项。 </li><li>为了获得最佳的重建结果中，选择的实验条件下，例如，在采集过程中在10,000和15,000之间的最大强度计数。漂白如果是一个问题，也可以使用在一个较低的曝光（5000和10000之间的数）的成像。理想情况下，不应该减少计数超过整个采集过程中的两个因素，应避免超过四个因素的减少。如果有必要，减少组的厚度，以确保持续的强度计数。相机饱和，所以在64,000计数最大张力不应该超过此值。为了获得良好的样本，我们发现1％的激光传输的实验条件下，10〜50毫秒的曝光时间。可以反复成像明亮的和耐光样品的首选。需要一个稳定的污渍时间推移，超分辨图像。 </li><li>为了减少噪音，95MHz读出速度（中等速度选项）和采集时间为2毫秒或以上推荐。增加文物得到重建成像，当样品在收购移动。由于这个影响，短期风险，建议非贴壁或快速移动的细胞。 </li><li>多通道成像可以同时或依次进行。顺序模式产量减少串扰和建议。 </li><li>为了减少光漂白，一般建议图像较长的激发波长（532纳米，488纳米和410纳米）。然而，对于在图3所示的实验结果，该顺序是反向。（ 即 48纳米，532纳米和410纳米）由于这个特定样品的光稳定性。 </li><li>设置上限/下限的Z堆栈的顶部/底部的细胞移动显微镜阶段，直到稍微失焦。在0.125微米的超分辨率成像所需的每幅图像之间的距离应保持不变，重建软件借此为默认值。 </li><li>图像重建栈使用SoftWorX（应用精密，WA）和分析使用的6.0 VoloCITY（Perkin Elmer公司，MA）。 </li></ol>

<ol>
	<li>Kim, R. H., Coates, J. M., Bowles, T. L., McNerney, G. P., Sutcliffe, J., Jung, J. U., Gandour-Edwards, R., Chuang, F. Y., Bold, R. J., Kung, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arginine+deiminase+as+a+novel+therapy+for+prostate+cancer+induces+autophagy+and+caspase-independent+apoptosis.">Arginine deiminase as a novel therapy for prostate cancer induces autophagy and caspase-independent apoptosis.</a> Cancer Res. 69 (2), 700-708 (2009).</li><li>Miyazaki, K., Takaku, H., Umeda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+growth+inhibition+of+human+tumor+cells+in+culture+by+arginine+deiminase+purified+from+a+culture+medium+of+a+Mycoplasma-infected+cell+line.">Potent growth inhibition of human tumor cells in culture by arginine deiminase purified from a culture medium of a Mycoplasma-infected cell line.</a> Cancer Res. 50, 4522-4527 (1990).</li><li>Takaku, H., Matsumoto, M., Misawa, S., Miyazaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-tumor+activity+of+arginine+deiminase+from+Mycoplasma+argini+and+its+growth-inhibitory+mechanism.">Anti-tumor activity of arginine deiminase from Mycoplasma argini and its growth-inhibitory mechanism.</a> Jpn. J. Cancer Res. 86, 840-846 (1995).</li><li>Levine, B., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+by+self-digestion:+molecular+mechanisms+and+biological+functions+of+autophagy.">Development by self-digestion: molecular mechanisms and biological functions of autophagy.</a> Dev. Cell. 6, 463-477 (2004).</li><li>Mizushima, N., Levine, B., Cuervo, A. M., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+fights+disease+through+cellular+self-digestion.">Autophagy fights disease through cellular self-digestion.</a> Nature. 451, 1069-1075 (2008).</li><li>Kabeya, Y., Mizushima, N., Ueno, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LC3,+a+mammalian+homologue+of+yeast+Apg8p,+is+localized+in+autophagosome+membranes+after+processing.">LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing.</a> EMBO J. 19, 5720-5728 (2000).</li><li>Pattingre, S., Espert, L., Biard-Piechaczyk, M., Codogno, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+macroautophagy+by+mTOR+and+Beclin+1+complexes.">Regulation of macroautophagy by mTOR and Beclin 1 complexes.</a> Biochimie. 90, 313-323 (2008).</li><li>Maiuri, M. C., Criollo, A., Tasdemir, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BH3-only+proteins+and+BH3mimetics+induce+autophagy+by+competitively+disrupting+the+interaction+between+Beclin+1+and+Bcl-2/Bcl-X(L).">BH3-only proteins and BH3mimetics induce autophagy by competitively disrupting the interaction between Beclin 1 and Bcl-2/Bcl-X(L).</a> Autophagy. 3, 374-376 (2007).</li><li>Crighton, D., Wilkinson, S., O'Prey, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DRAM,+a+p53-induced+modulator+of+autophagy,+is+critical+for+apoptosis.">DRAM, a p53-induced modulator of autophagy, is critical for apoptosis.</a> Cell. 126, 121-134 (2008).</li><li>Dillon, B. J., Prieto, V. G., Curley, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incidence+and+distribution+of+argininosuccinate+synthetase+deficiency+in+human+cancers:+a+method+for+identifying+cancers+sensitive+to+arginine+deprivation.">Incidence and distribution of argininosuccinate synthetase deficiency in human cancers: a method for identifying cancers sensitive to arginine deprivation.</a> Cancer. 100, 826-833 (2004).</li><li>Dale, B. M., McNerney, G. P., Thompson, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-to-cell+transfer+of+HIV-1+via+virological+synapses+leads+to+endosomal+virion+maturation+that+activates+viral+membrane+fusion.">Cell-to-cell transfer of HIV-1 via virological synapses leads to endosomal virion maturation that activates viral membrane fusion.</a> Cell Host &amp; Microbe. 10 (6), 551-562 (2011).</li><li>Cogger, V. C., McNerney, G. P., Nyunt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+structured+illumination+microscopy+of+liver+sinusoidal+endothelial+cell+fenestrations.">Three-dimensional structured illumination microscopy of liver sinusoidal endothelial cell fenestrations.</a> J. Struct. Biol. 171 (3), 382-388 (2010).</li><li>York, A. G., Parekh, S. H., Nogare, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+doubling+in+live,+multicellular+organisms+via+multifocal+structured+illumination+microscopy.">Resolution doubling in live, multicellular organisms via multifocal structured illumination microscopy.</a> Nat. Methods. 9 (7), 749-754 (2012).</li><li>Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy.">Surpassing the lateral resolution limit by factor of two using structured illumination microscopy.</a> Journal of Microscopy. 198, 82-87 (2000).</li><li>Shao, L., Kner, P., Rego, E. H., Gustaffson, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+3D+microscopy+of+live+whole+cells+using+structured+illumination.">Super-resolution 3D microscopy of live whole cells using structured illumination.</a> Nat. Method. 8 (12), 1044-1046 (2011).</li></ol>

没有利益冲突的声明。

虽然被广泛接受为一个标准的方法来确认自噬反应6相同的系统（因为我们已经做了），定量三维成像提供了前所未有的信息和细节的复杂过程，细胞自噬对LC3荧光探针标记细胞直接观察。特别是，我们观察到自噬诱导后80分钟内，数百（如果不是数千）在活细胞中的自噬体形成。同样，我们观察到在自噬诱导溶酶体舱室的分布非常有趣的形态学变化。在一个给定的单元格，在自噬体的数?...

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arginine Deiminase (ADI)</td>
			<td>DesigneRx</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casein</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5890</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>4042</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S4521</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa anti-mouse 555</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21422</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa anti-rabbit 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21244</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysoTracker Red DND-99</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L7528</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Lamp1</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>H4A3</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Cadherin</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#3195</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SlowFade Gold</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S36936</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm poly-d-lysine coated glass bottom plate</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35GC-1.5-1.4-C</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No.1, 22 mm coverslip</td>
			<td>Corning</td>
			<td>#2865-22</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1324G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative analysis of autophagy using advanced 3d fluorescence microscopy

手术虽然带有明显的阳痿和尿失禁的风险，前列腺癌是美国男性恶性肿瘤之间的主要形式，传统的化疗方法已基本成功。激素治疗是有效的，在早期阶段，但往往失败，并最终发展为激素难治性肿瘤。我们一直有兴趣在开发针对特定的肿瘤细胞代谢缺陷的疗法。我们最近发现，前列腺肿瘤细胞的特异性缺乏一种酶（精氨琥珀酸合成酶，或ASS）的合成中所涉及的氨基酸精氨酸1。这种情况会导致肿瘤细胞变得依赖于外生精氨酸，他们经过代谢应激游离精氨酸耗尽时由精氨酸脱亚胺酶（ADI）1,10。事实上，我们已经表明，人类前列腺癌细胞CWR22 RV1有效地杀死ADI依赖caspase的细胞凋亡和积极autophaGY（或macroautophagy）1,2,3。细胞自噬是一种进化上保守的过程，使细胞代谢多余的蛋白质在营养饥饿4,5溶酶体破裂。虽然这一途径的重要组成部分，良好的特点6,7,8,9，很多方面的分子机制仍不清楚-特别是，什么是自噬作用的前列腺癌细胞死亡响应ADI治疗后？为了解决这个问题，我们需要的实验方法来衡量的水平和程度在细胞中的自噬反应 - 因为没有已知的分子标记物，可以准确地跟踪这个过程中，我们选择了开发基于成像的方法，使用定量三维荧光显微镜11,12的 。 使用专门CWR22Rv1细胞自噬体和溶酶体的荧光探针标记，我们证明了收购3D图像栈或者无线defield卷积显微镜（以及后来的超高分辨率，结构照明显微镜），可以清晰地捕捉到自噬诱导的早期阶段。市售数字图像分析的应用程序，我们可以很容易地获得统计信息自噬体和溶酶体的数量，规模，分布和程度从任何成像细胞共存。这个信息让我们能够精确地跟踪在活细胞自噬的进展，使我们继续调查自噬作用在癌症化疗。

图1中所示的图象序列显示在第一个80分钟的自噬诱导的在CWR22细胞发生的物理变化。在这方面和其他的研究（图中未示出）中，我们持续观察到：（1）核内的位移相差的小区中心;（2）减少了粘着点，以及（3）朝向中心的自噬体和溶酶体一般易位细胞。此外，我们还观察到自噬体和溶酶体（绿色）（红色）之间的共存小幅增加（黄色），在稍后的时间点。 基于?...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

细胞自噬是一个无处不在的进程，使细胞蛋白质和细胞器的降解和回收利用。我们采用先进的荧光显微镜可视化和量化小，但必要的，与诱导自噬相关的物理变化，包括自噬体和溶酶体的形成和分布，以及他们融合成auto​​lysosomes。

采用先进的3D荧光显微镜定量分析自噬

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

quantitative-analysis-autophagy-using-advanced-3d-fluorescence

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Unit 1

Cell Death

SCIENTISTS IN ACTION

17.8K 次观看.  University of California, Davis. 细胞自噬是一个无处不在的进程，使细胞蛋白质和细胞器的降解和回收利用。我们采用先进的荧光显微镜可视化和量化小，但必要的，与诱导自噬相关的物理变化，包括自噬体和溶酶体的形成和分布，以及他们融合成auto​​lysosomes。