الدعم المنحة: المعاهد الوطنية للصحة CA165263، المعاهد الوطنية للصحة CA150197، المعاهد الوطنية للصحة CA150197S1 (HJ الكونغ)، NIH CA150197S1 (CA Changou)، NSF PHY-0120999 مركز بيوفوتونيك علوم والتكنولوجيا (DL ولفسون، FYS تشوانغ)، وزارة الدفاع PC073420 (RJ بولد)، والبحوث مجلس النرويج، ييف ايريكسون السفر جرانت 209286/F11 (BS أهلواليا). كما يقر HJ الكونغ بدعم من صندوق أوبورن السرطان جماعة الوقف. كما يقر RJ بولد بدعم من جون ماكدونالد الوقف. نشكر الدكتور جيني وي جين الكونغ والدكتور بوروسيا ون وو في DesigneRx لتوريد سخية من ADI.

1. الجزء 1: خلية ثقافة وصفها المناعية فلوري <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو الخلايا السرطانية CWR22 RV1 البروستاتا الذي يصيب الانسان على الزجاج coverslips على (# 1.5 أو 170 ميكرون سمك) وضعت في 6 لوحات جيدا، مع RPMI (Mediatech، VA) تحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) و 1٪ البنسلين / الستربتوميسين / الجلوتامين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لحث الالتهام الذاتي عن طريق التعامل مع عينات مختارة أرجينين deiminase (ADI، 0.3 ميكروغرام / مل) في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح الخلايا مع بارافورمالدهيد 4٪ (PFA، فيشر العلمية، NH) المخفف في برنامج تلفزيوني و 100 ميكرولتر في ساترة، لمدة 10 دقيقة في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا 3x مع 1 مل HBS / BSA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Permeabilize الخلايا مع سابونين 0.05٪ (سيغما، MO) في HEPES (HBS) / BSA، و 100 ميكرولتر في ساترة، لمدة 15 دقيقة في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل المناعية وضع العلامات، وعينات كتلة مع 2.5٪ الكازين (سيغما، MO) في HBS / BSA، و 100 ميكرولتر في ساترة، لمدة 1 ساعة على RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان خلايا ثابتة مع الأجسام المضادة الأولية مخففة في 2.5٪ الكازين / HBS / BSA، و 100 ميكرولتر لكل coverslIP، O / N عند 4 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا 3x مع 1 مل HBS / BSA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان خلايا ثابتة مع الأجسام المضادة الثانوية المخفف في 2.5٪ الكازين / HBS / BSA، و 100 ميكرولتر في ساترة، لمدة 1 ساعة على RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا 3x مع 1 مل HBS / BSA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جبل coverslips على استعداد على الشرائح العادية المجهر والزجاج مع الذهب SlowFade أو إطالة الذهب كاشف antifade (إينفيتروجن، CA) التي تحتوي على 4 &#39;،6-diamidino-2-phenylindole (دابي). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حواف ختم ساترة مع طلاء الأظافر. للحصول على أفضل نتائج التصوير، إتاحة الوقت (مثالي O / N) لوسائل الإعلام لمكافحة تتلاشى تماما تتخلل الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنظيف سطح ساترة مع الميثانول و / أو الكلوروفورم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة زيت الغمر (معامل الانكسار 1.520 عند التصوير عند 37 درجة مئوية، أو 1.516 عند التصوير في RT) إلى 60X 1.42 NA عدسة الهدف (أوليمبوس، اليابان). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الشريحة موقف على المسرح المجهر ووضع التركيز مع خلايا الفائدة. </li></ol> 2. الجزء 2: خلايا التحضير لتصوير لايف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو CWR22 RV1 الخلايا معربا عن الفلورية الخضراء البروتين يقترن ضوء سلسلة 3 (LC3-GFP) في وسائل الإعلام ثقافة RPMI تحتوي على FBS 10٪ و 1٪ على المضادات الحيوية 35 ملم بولي-D-يسين المغلفة أطباق ثقافة زجاج القاع (ماتيك، MA). ينبغي مطلي الخلايا في كثافة كافية لتسهيل الانتشار السريع، ولكن ليس كثيرا أن الخلايا هي متضخمة وتجمعت بحلول موعد التصوير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> علاج عينات الخلية المحددة مع ADI (0.3 ميكروغرام / مل) في برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حوالي 1 ساعة قبل التصوير، وتمييع 1.5 ميكرولتر من LysoTracker الأحمر DND-99 (إينفيتروجن، كاليفورنيا) مع 20 مل RPMI. تحتوي على 10٪ FBS و 1٪ المضادات الحيوية. استخدام المحاليل المحتوية على ADI للعينات المختارة. الحارة جميع وسائل الإعلام إلى 37 درجة مئوية قبل إضافة إلى الطبق الثقافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا مع RPMI تحتوي على LysoTracker الأحمر DND-99 ل15-45 دقيقة عند 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ما يقرب من 30 دقيقة قبل التصوير، بدوره على العلبة البيئية WeatherStation والسماح لتتوازن إلى 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 (مع humidifالهواء IED). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني واستبدال وسائل الإعلام مع معيار RPMI FBS تحتوي على 10٪ فقط، و 1٪ المضادات الحيوية. أضف إلى ADI عينات كما هو محدد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جبل 35 مم ساترة القاع أطباق الثقافة في محول حسب اختيارك (الدقة، وشركة، WA)، وموقف على المسرح المجهر. استخدام زيت الغمر (معامل الانكسار 1.520) على 60X 1.42 NA عدسة الهدف، ووضع الطبق الثقافة التي شنت على خشبة المسرح. </li></ol> 3. الجزء 3: الميكروسكوب Deconvolution وتحليل بروتوكول في هذا القسم يفترض استخدام DeltaVision الشخصية DV المجهر deconvolution وما يرتبط بها من SoftWorX تطبيق جناح (الدقة، وشركة، WA). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على نظام المجهر، بما في ذلك محطة اقتناء وحدة تحكم الصك. فتح تطبيق Resolve3D لتهيئة المسرح المجهر وبدوره على مصدر ضوء زينون. سماح 10 دقيقة لمصدر الضوء في عملية الاحماء والوصول إلى ظروف مستقرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافةقطرة من زيت الغمر (معامل الانكسار 1.520 للعينات الحية عند 37 درجة مئوية أو 1.516 لعينات ثابتة في RT) على 60X 1.42 NA عدسة الهدف، وعينة الشريحة المركز (زلة تغطية الوجه لأسفل) على عدسة الهدف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إما باستخدام الإضاءة مشرق الميدان أو الخارجية والتركيز الخشنة ضبط مقبض الباب، رفع ببطء عدسة الهدف حتى حبة من النفط الغمر يجعل الاتصال مع غطاء زجاجي مقلوب. (من هذه النقطة، يجب أن تأتي طبقة الخلايا إلى التركيز في غضون بضعة يتحول من التركيز غرامة ضبط مقبض الباب). عند العمل مع عينات ثابتة على الشرائح، فمن المستحسن تجنب الخلايا داخل أي مجال من المجالات مع فقاعات أو بالقرب منها. عند عرض مع عينات حية على طبق زجاج القاع، وتجنب تحريك عدسة الهدف خارج حدود ساترة الزجاج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن تحديد Autophagosomes بواسطة EGFP إشارة (الخضراء). ويتم تحديد الجسيمات الحالة من قبل LysoTracker الأحمر (عينة حية) أو الأجسام المضادة الفلورسنت مكافحة Lamp1 (عينة ثابتة). ويتم تحديد نوى الخلايا بواسطة دابي شارعaining (عينة ثابتة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد الحقل المطلوب من الرأي. من الناحية المثالية، ينبغي أن الخلايا تظهر إشارة الفلورسنت جيدة في جميع القنوات المناسبة، وتعلق، وانتشرت على سطح ساترة بحيث محتويات الخلايا من السهل تصور بما فيه الكفاية. تعديلات صغيرة في العاشر الوحشي، Y، Z والتركيز يمكن التحكم عن طريق الكمبيوتر باستخدام واجهة Acquire3D. تعيين binning إلى 1X1 أو 2X2، اعتمادا على الحقل المطلوب من عرض (ويمكن رؤية أكثر من الخلايا في الحقل عند تعيين binning إلى 2X2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للحصول على صورة معينة من خلال القسم الوسطي للخلية، تعيين المعلمات التعرض (مثل٪ انتقال السلطة وزمن التعرض) مثل أن الحد الأقصى لكثافة بكسل لا يتجاوز 3،000 التهم الموجهة إليه. عموما، يجب تعيين انتقال٪ عند أدنى مستوى ممكن، من دون التطرق الى زمن التعرض المقابلة أكثر من 1 ثانية. كرر هذا الإجراء كل لون مضان ليمكن تصوير ولكل حقل منفصل من أجل الحصول على صور عالية الجودة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين Uحدود pper والسفلي من Z-مكدس عن طريق ضبط التركيز فقط قليلا عبر الجزء العلوي والسفلي من عينة الخلية، على التوالي. العدد الكلي من الصور في إعطاء Z-مكدس وهكذا يحدده هذه الحدود والتباعد بين الطبقات (القيمة الافتراضية: 0.2 ميكرون). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتقليل الحركة الفنية خلال الحصول على الصور، ونحن نوصي تحديد طريقة الحصول على الصور ل&quot;الطول الموجي ثم ض المكدس&quot; للعينات ثابتة، و &quot;ض المكدس ثم الطول الموجي&quot; للحصول على عينات حية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وdeconvolved الصور مضان باستخدام SoftWorX (الدقة التطبيقية، WA) وتحليلها لاحقا باستخدام VoloCITY (الارتجال، والآن بيركن إلمر، MA). </li></ol> 4. جزء 4: سوبر القرار، منظم في الإضاءة (OMX) الميكروسكوب بروتوكول في هذا القسم ينطبق على استخدام OMX مجهر الإضاءة الهيكلية (الدقة التطبيقية، WA). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تبديل على السلطة الرئيسية والليزر المطلوبة (410 نانومتر، 488 نانومتر، و / أو 532 نانومتر). الانتظار لمدة 20 ميلn للحصول على أشعة الليزر لأن يستقر حراريا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة زيت الغمر (معامل الانكسار 1.516 للعينات ثابتة في RT) على 60X 1.42 NA عدسة الهدف. إذا كان ينظر إلى فقاعات في قطيرة الزيت، وتنظيف موضوعية وإضافة زيت مرة أخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع الشريحة عينة على المسرح وإذا لزم الأمر، والسماح 10 دقيقة للخلايا ليستقر على ساترة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تهيئة برنامج الاستحواذ. استخدام الإضاءة مضان لضبط التركيز حتى يمكن رؤية الخطوط العريضة الحادة للخلية. (وينبغي توخي الحذر في جميع الأوقات للحد من التعرض للخلايا لإثارة مضان، حتى الحصول على الصور الفعلية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمكن الحصول على تفحص فسيفساء دوامة لمعاينة مناطق أوسع من العينة لتحديد الخلايا أو المناطق ذات الاهتمام. فمن المستحسن استخدام مرات التعرض قصير (1-10 مللي ثانية)، وانخفاض القوة الإثارة (0.1-1٪ انتقال)، في حين مسح العينة أو العثور الأهداف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد autophagosomes بواسطة GFP-LC3 مضان. تحديد الجسيمات الحالة من قبل اليكسا فلور 555 المضادة للLAMP(بروتين غشاء يحلول المصاحب) ونوى الخلايا باستخدام دابي (عينات ثابتة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار الظروف التجريبية بما في ذلك الطول الموجي الإثارة، مساحة الصورة (على سبيل المثال 512X512)، سمك مكدس، وقت التعرض، ونسبة انتقال الليزر. عن Super الصور حل، وضمان أن يتم تمكين الخيار إضاءة منظم. للفحص المجهري deconvolution على OMX، حدد خيار الإضاءة التقليدية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للحصول على أفضل النتائج التعمير، حدد الظروف التجريبية مثل أن الحد الأقصى لكثافة عدد ما بين 10،000 و 15،000 خلال عملية الاستحواذ. إذا photobleaching هو مصدر قلق، والتصوير في انخفاض التعرض (التهم بين 5،000 و 10،000) يمكن استخدامها. من الناحية المثالية، ينبغي أن التهم ولا تنقص أكثر من عامل من اثنين خلال اقتناء كامل، وينبغي تجنب انخفاض بأكثر من أربعة أضعاف. إذا لزم الأمر، والحد من سماكة كومة لضمان العد شدة المستدام. الكاميرا التشبع في 64،000 التهم، والحد الأقصى وذلك فيتوتر لا ينبغي أبدا تتجاوز هذا. للحصول على عينات جيدة، وجدنا الظروف التجريبية لتكون 10 ~ 50 ميللي ثانية زمن التعرض مع انتقال الليزر 1٪. ويفضل عينات مشرق وصامد التي يمكن تصويرها مرارا وتكرارا. مطلوب مستقرة وصمة عار لمرور الزمن، سوبر الصور حلها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للحد من الضوضاء، سرعة قراءات 95MHz (الخيار سرعة متوسطة) واكتساب الوقت من 2 ميللي ثانية أو أكثر يوصى. ويتم الحصول على زيادة الأعمال الفنية المصورة في إعادة بنائها، وعندما يتحرك عينة خلال عملية الاستحواذ. ونتيجة لهذا التأثير، ينصح التعرض القصير لخلايا غير ملتصقة أو سريعة الحركة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لا يمكن أن يؤديها التصوير متعددة في وقت واحد أو بالتتابع. وهكذا أوصى غلة وضع متتابعة أقل عبر الحديث و. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للحد من photobleaching، فمن المستحسن عموما إلى صورة مع موجات أطول الإثارة الأول (532 نانومتر، 488 نانومتر، ومن ثم 410 نانومتر). ومع ذلك، من أجل النتائج التجريبية هو مبين في الشكل (3)، وكان هذا ترتيب عكسيد (أي 48 نانومتر، 532 نانومتر و 410 نانومتر) وذلك بسبب صمود هذه عينة معينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين الحد العلوي / السفلي من Z-مكدس عن طريق تحريك خشبة المسرح المجهر حتى أعلى / أسفل الخلايا قليلا من التركيز. ينبغي أن تعقد المسافة المطلوبة بين كل صورة ثابتة عند 0.125 ميكرون لسوبر القرار التصوير، كبرنامج إعادة الإعمار ستستغرق هذه القيمة كما الافتراضي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة بناء مداخن صورة باستخدام SoftWorX (الدقة التطبيقية، WA) وتحليل باستخدام VoloCITY 6.0 (بيركن إلمر، MA). </li></ol>

<ol>
	<li>Kim, R. H., Coates, J. M., Bowles, T. L., McNerney, G. P., Sutcliffe, J., Jung, J. U., Gandour-Edwards, R., Chuang, F. Y., Bold, R. J., Kung, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arginine+deiminase+as+a+novel+therapy+for+prostate+cancer+induces+autophagy+and+caspase-independent+apoptosis.">Arginine deiminase as a novel therapy for prostate cancer induces autophagy and caspase-independent apoptosis.</a> Cancer Res. 69 (2), 700-708 (2009).</li><li>Miyazaki, K., Takaku, H., Umeda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+growth+inhibition+of+human+tumor+cells+in+culture+by+arginine+deiminase+purified+from+a+culture+medium+of+a+Mycoplasma-infected+cell+line.">Potent growth inhibition of human tumor cells in culture by arginine deiminase purified from a culture medium of a Mycoplasma-infected cell line.</a> Cancer Res. 50, 4522-4527 (1990).</li><li>Takaku, H., Matsumoto, M., Misawa, S., Miyazaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-tumor+activity+of+arginine+deiminase+from+Mycoplasma+argini+and+its+growth-inhibitory+mechanism.">Anti-tumor activity of arginine deiminase from Mycoplasma argini and its growth-inhibitory mechanism.</a> Jpn. J. Cancer Res. 86, 840-846 (1995).</li><li>Levine, B., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+by+self-digestion:+molecular+mechanisms+and+biological+functions+of+autophagy.">Development by self-digestion: molecular mechanisms and biological functions of autophagy.</a> Dev. Cell. 6, 463-477 (2004).</li><li>Mizushima, N., Levine, B., Cuervo, A. M., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+fights+disease+through+cellular+self-digestion.">Autophagy fights disease through cellular self-digestion.</a> Nature. 451, 1069-1075 (2008).</li><li>Kabeya, Y., Mizushima, N., Ueno, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LC3,+a+mammalian+homologue+of+yeast+Apg8p,+is+localized+in+autophagosome+membranes+after+processing.">LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing.</a> EMBO J. 19, 5720-5728 (2000).</li><li>Pattingre, S., Espert, L., Biard-Piechaczyk, M., Codogno, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+macroautophagy+by+mTOR+and+Beclin+1+complexes.">Regulation of macroautophagy by mTOR and Beclin 1 complexes.</a> Biochimie. 90, 313-323 (2008).</li><li>Maiuri, M. C., Criollo, A., Tasdemir, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BH3-only+proteins+and+BH3mimetics+induce+autophagy+by+competitively+disrupting+the+interaction+between+Beclin+1+and+Bcl-2/Bcl-X(L).">BH3-only proteins and BH3mimetics induce autophagy by competitively disrupting the interaction between Beclin 1 and Bcl-2/Bcl-X(L).</a> Autophagy. 3, 374-376 (2007).</li><li>Crighton, D., Wilkinson, S., O'Prey, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DRAM,+a+p53-induced+modulator+of+autophagy,+is+critical+for+apoptosis.">DRAM, a p53-induced modulator of autophagy, is critical for apoptosis.</a> Cell. 126, 121-134 (2008).</li><li>Dillon, B. J., Prieto, V. G., Curley, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incidence+and+distribution+of+argininosuccinate+synthetase+deficiency+in+human+cancers:+a+method+for+identifying+cancers+sensitive+to+arginine+deprivation.">Incidence and distribution of argininosuccinate synthetase deficiency in human cancers: a method for identifying cancers sensitive to arginine deprivation.</a> Cancer. 100, 826-833 (2004).</li><li>Dale, B. M., McNerney, G. P., Thompson, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-to-cell+transfer+of+HIV-1+via+virological+synapses+leads+to+endosomal+virion+maturation+that+activates+viral+membrane+fusion.">Cell-to-cell transfer of HIV-1 via virological synapses leads to endosomal virion maturation that activates viral membrane fusion.</a> Cell Host &amp; Microbe. 10 (6), 551-562 (2011).</li><li>Cogger, V. C., McNerney, G. P., Nyunt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+structured+illumination+microscopy+of+liver+sinusoidal+endothelial+cell+fenestrations.">Three-dimensional structured illumination microscopy of liver sinusoidal endothelial cell fenestrations.</a> J. Struct. Biol. 171 (3), 382-388 (2010).</li><li>York, A. G., Parekh, S. H., Nogare, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+doubling+in+live,+multicellular+organisms+via+multifocal+structured+illumination+microscopy.">Resolution doubling in live, multicellular organisms via multifocal structured illumination microscopy.</a> Nat. Methods. 9 (7), 749-754 (2012).</li><li>Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy.">Surpassing the lateral resolution limit by factor of two using structured illumination microscopy.</a> Journal of Microscopy. 198, 82-87 (2000).</li><li>Shao, L., Kner, P., Rego, E. H., Gustaffson, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+3D+microscopy+of+live+whole+cells+using+structured+illumination.">Super-resolution 3D microscopy of live whole cells using structured illumination.</a> Nat. Method. 8 (12), 1044-1046 (2011).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

في حين أن الملاحظة المباشرة من الخلايا المسمى مع تحقيقات الفلورسنت ضد LC3 مقبولة على نطاق واسع كوسيلة القياسية لتأكيد استجابة autophagic 6، والتصوير 3D الكمي من النظام نفسه (كما فعلنا) يقدم معلومات غير مسبوقة والتفاصيل حول عملية معقدة من الالتهام الذاتي الخلوي . على وج...

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arginine Deiminase (ADI)</td>
			<td>DesigneRx</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casein</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5890</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>4042</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S4521</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa anti-mouse 555</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21422</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa anti-rabbit 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21244</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysoTracker Red DND-99</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L7528</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Lamp1</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>H4A3</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Cadherin</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#3195</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SlowFade Gold</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S36936</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm poly-d-lysine coated glass bottom plate</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35GC-1.5-1.4-C</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No.1, 22 mm coverslip</td>
			<td>Corning</td>
			<td>#2865-22</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1324G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative analysis of autophagy using advanced 3d fluorescence microscopy

سرطان البروستاتا هو الشكل الرائدة في مجال الأورام الخبيثة بين الرجال في الولايات المتحدة، بينما جراحة يحمل مخاطر كبيرة من العجز الجنسي وسلس البول، وقد كان النهج العلاج الكيميائي التقليدي غير ناجحة إلى حد كبير. العلاج الهرموني فعال في مرحلة مبكرة، ولكن غالبا ما يفشل مع التنمية في نهاية المطاف من الأورام هرمون الحرارية. لقد تم مهتمة في تطوير علاجات تستهدف نقص التمثيل الغذائي محددة من الخلايا السرطانية. أظهرنا مؤخرا أن الخلايا السرطانية تفتقر البروستاتا على وجه التحديد انزيم (سينسيز أرجينينوسكسينات، أو ASS) تشارك في تركيب الأحماض الأمينية أرجينين 1. هذا الشرط يسبب الخلايا السرطانية لتصبح تعتمد على أرجينين الخارجية، وأنها تخضع الإجهاد الأيضي عندما يتم استنفاد أرجينين مجانا من أرجينين deiminase (ADI) 1،10. في الواقع، ونحن قد أظهرت أن خلايا سرطان البروستاتا البشرية CWR22 RV1 يتعرضون للقتل على نحو فعال من قبل ADI مع موت الخلايا المبرمج كاسباس مستقلة وautopha العدوانيةغراي (أو macroautophagy) 1،2،3. الالتهام الذاتي هو عملية تطويريا-الحفظ التي تسمح الخلايا على استقلاب البروتينات غير المرغوب فيها من قبل انهيار الليزوزومية خلال المجاعة الغذائية 4،5. على الرغم من أن المكونات الأساسية لهذا المسار جيدا يتميز 6،7،8،9، العديد من جوانب الآلية الجزيئية لا تزال غير واضحة - على وجه الخصوص، ما هو دور الالتهام الذاتي في وفاة والاستجابة من خلايا سرطان البروستاتا بعد العلاج ADI ؟ من أجل معالجة هذه المسألة، ونحن يتطلب المنهج التجريبي لقياس مستوى ومدى استجابة autophagic في الخلايا - وبما أنه لا توجد الواسمات الجزيئية المعروفة التي يمكن أن تتبع بدقة هذه العملية، اخترنا لتطوير نهج قائم على التصوير، وذلك باستخدام الكمية المجهري مضان 3D 11،12. باستخدام CWR22Rv1 الخلايا على وجه التحديد المسمى مع تحقيقات الفلورسنت لautophagosomes والجسيمات الحالة، وتبين لنا أن مداخن صورة 3D المكتسبة مع أي وايdefield المجهر deconvolution (وفيما بعد، مع فائق الدقة، المجهري منظم في الإضاءة) يمكن التقاط بوضوح المراحل المبكرة من تحريض الالتهام الذاتي. مع المتاحة تجاريا تطبيقات تحليل الصور الرقمية، ويمكننا الحصول بسهولة على معلومات إحصائية عن عدد جسيم بلعمي ذاتي ويحلول والحجم والتوزيع، ودرجة colocalization من أي خلية المصورة. هذه المعلومات يسمح لنا لتتبع بدقة التقدم من الالتهام الذاتي في الخلايا الحية، ويمكن استمرار تحقيقاتنا في دور الالتهام الذاتي في العلاج الكيميائي للسرطان.

تسلسل الصور هو مبين في الشكل 1 يبين التغيرات الجسدية التي تحدث في CWR22 الخلايا خلال 80 دقيقة الأولى من تحريض الالتهام الذاتي. في هذه الدراسات وغيرها (لا يظهر) لاحظنا باستمرار: (1) النزوح من النواة بعيدا عن مركز الخلية، (2) الحد من التصاق نقطة الوصل، و (3) إزفاء العام ...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

الالتهام الذاتي هو عملية في كل مكان التي تمكن الخلايا تتحلل وإعادة تدوير البروتينات والعضيات. نحن نطبق المجهري مضان متقدمة لتصور وقياس صغيرة، ولكن التغييرات الأساسية، المادية المرتبطة تحريض الالتهام الذاتي، بما في ذلك تشكيل وتوزيع autophagosomes والجسيمات الحالة، والانصهار بهم إلى autolysosomes.

التحليل الكمي الالتهام الذاتي باستخدام المجهر مضان المتقدم 3D

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

quantitative-analysis-autophagy-using-advanced-3d-fluorescence

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Unit 1

Cell Death

SCIENTISTS IN ACTION

17.8K Views.  University of California, Davis. الالتهام الذاتي هو عملية في كل مكان التي تمكن الخلايا تتحلل وإعادة تدوير البروتينات والعضيات. نحن نطبق المجهري مضان متقدمة لتصور وقياس صغيرة، ولكن التغييرات الأساسية، المادية المرتبطة تحريض الالتهام الذاتي، بما في ذلك تشكيل وتوزيع autophagosomes والجسيمات الحالة، و...

Video: Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular level. To date the shear complexity of biological systems has caused precise single-molecule experimentation to be far too demanding, instead focusing on studies of single systems using relatively crude bulk ensemble-average measurements. However, many important processes occur in the living cell at the level of just one or a few molecules; ensemble measurements generally mask the stochastic and heterogeneous nature of these events. Here, using advanced optical microscopy and analytical image analysis tools we demonstrate how to monitor proteins within a single living bacterial cell to a precision of single molecules and how we can observe dynamics within molecular complexes in functioning biological machines. The techniques are directly relevant physiologically. They are minimally-perturbative and non-invasive to the biological sample under study and are fully attuned for investigations in living material, features not readily available to other single-molecule approaches of biophysics. In addition, the biological specimens studied all produce fluorescently-tagged protein at levels which are almost identical to the unmodified cell strains ("genomic encoding"), as opposed to the more common but less ideal approach for generating significantly more protein than would occur naturally ('plasmid expression'). Thus, the actual biological samples which will be investigated are significantly closer to the natural organisms, and therefore the observations more relevant to real physiological processes.

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Here we demonstrate the protocols for performing single-molecule fluorescence microscopy on living bacterial cells to enable functional molecular complexes to be detected, tracked and quantified.

تصور المجمعات الجزيئية واحدة في فيفو استخدام الميكروسكوب الإسفار متقدم

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

الوقت الفاصل بين التصوير من الانقسام الميتوزي بعد ترنسفكأيشن سيرنا

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

الكمية خلية حية الإسفار - المجهري تحليل الخميرة الانشطار

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During directional migration, cells move rapidly in response to an extracellular chemotactic signal, or in response to intrinsic cues 3 provided by the basic motility machinery. Random migration occurs when a cell possesses low intrinsic directionality, allowing the cells to explore their local environment.
Cell migration is a complex process, in the initial response cell undergoes polarization and extends protrusions in the direction of migration 2. Traditional methods to measure migration such as the Boyden chamber migration assay is an easy method to measure chemotaxis in vitro, which allows measuring migration as an end point result. However, this approach neither allows measurement of individual migration parameters, nor does it allow to visualization of morphological changes that cell undergoes during migration.
Here, we present a method that allows us to monitor migrating cells in real time using video - time lapse microscopy. Since cell migration and invasion are hallmarks of cancer, this method will be applicable in studying cancer cell migration and invasion in vitro. Random migration of platelets has been considered as one of the parameters of platelet function 4, hence this method could also be helpful in studying platelet functions. This assay has the advantage of being rapid, reliable, reproducible, and does not require optimization of cell numbers. In order to maintain physiologically suitable conditions for cells, the microscope is equipped with CO2 supply and temperature thermostat. Cell movement is monitored by taking pictures using a camera fitted to the microscope at regular intervals. Cell migration can be calculated by measuring average speed and average displacement, which is calculated by Slidebook software.

This method allows monitoring of cells in real time and quantitative measurements of different cell migration parameters such as speed, displacement, and velocity. Unlike the traditional methods, this real time approach is not based on endpoint quantitative migration measurements; instead it allows monitoring and calculating different parameters continuously.

التحليل الكمي للهجرة عشوائية من الخلايا باستخدام الوقت الفاصل بين الميكروسكوب فيديو

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

التصور والتحليل من جزيئات الرنا المرسال عن طريق الإسفار<em&gt; في الموضع</em&gt; التهجين في<em&gt; خميرة الخباز</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized image analysis tools are available, most traditional image-analysis-based workflows have steep learning curves (for fine tuning of analysis parameters) and result in long turnaround times between imaging and analysis. In particular, cell segmentation, the process of identifying individual cells in an image, is a major bottleneck in this regard.
Here we present an alternate, cell-segmentation-free workflow based on PhenoRipper, an open-source software platform designed for the rapid analysis and exploration of microscopy images. The pipeline presented here is optimized for immunofluorescence microscopy images of cell cultures and requires minimal user intervention. Within half an hour, PhenoRipper can analyze data from a typical 96-well experiment and generate image profiles. Users can then visually explore their data, perform quality control on their experiment, ensure response to perturbations and check reproducibility of replicates. This facilitates a rapid feedback cycle between analysis and experiment, which is crucial during assay optimization. This protocol is useful not just as a first pass analysis for quality control, but also may be used as an end-to-end solution, especially for screening. The workflow described here scales to large data sets such as those generated by high-throughput screens, and has been shown to group experimental conditions by phenotype accurately over a wide range of biological systems. The PhenoBrowser interface provides an intuitive framework to explore the phenotypic space and relate image properties to biological annotations. Taken together, the protocol described here will lower the barriers to adopting quantitative analysis of image based screens.

Here we describe a workflow for rapidly analyzing and exploring collections of fluorescence microscopy images using PhenoRipper, a recently developed image-analysis platform.

التحليل السريع واستكشاف الإسفار الميكروسكوب الصور

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells possess several lines of defense against damage to biologically relevant molecules like nucleic acids, lipids and proteins. In addition to organelle dynamics (fusion/fission/motility/inheritance) and tightly controlled protease activity, the degradation of surplus, damaged or compromised organelles by autophagy (cellular &#8216;self-eating&#8217;) has received much attention from the scientific community. The regulation of autophagy is quite complex and depends on genetic and environmental factors, many of which have so far not been elucidated. Here a novel method is presented that allows the convenient study of autophagy in the filamentous fungus Penicillium chrysogenum. It is based on growth of the fungus on so-called &#8216;starvation pads&#8217; for stimulation of autophagy in a reproducible manner. Samples are directly assayed by microscopy and evaluated for autophagy induction / progress. The protocol presented here is not limited for use with P. chrysogenum and can be easily adapted for use in other filamentous fungi.

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

A convenient and powerful method for studying autophagy in Penicillium chrysogenum by using starvation pads (mixtures of agarose and tap water in a microscope slide containing a central cavity) is presented here.

تحليل الالتهام الذاتي في<em&gt; البنسليوم العسجدية</em&gt; باستخدام التجويع وسادات في تركيبة مع المجهر مضان

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells ...

Identification of Kinesin-1 Cargos Using Fluorescence Microscopy

Fluorescence microscopy is employed to identify Kinesin-1 cargos. Recently, the heavy chain of Kinesin-1 (KIF5B) was shown to transport the nuclear transcription factor c-MYC for proteosomal degradation in the cytoplasm. The method described here involves the study of a motorless KIF5B mutant for fluorescence microscopy. The wild-type and motorless KIF5B proteins are tagged with the fluorescent protein tdTomato. The wild-type tdTomato-KIF5B appears homogenously in the cytoplasm, while the motorless tdTomato-KIF5B mutant forms aggregates in the cytoplasm. Aggregation of the motorless KIF5B mutant induces aggregation of its cargo c-MYC in the cytoplasm. Hence, this method provides a visual means to identify the cargos of Kinesin-1. A similar strategy can be utilized to identify cargos of other motor proteins.

Here, a protocol is presented to identify Kinesin-1 cargos. A motorless mutant of the Kinesin-1 heavy chain (KIF5B) aggregates in the cytoplasm and induces aggregation of its cargos. Both aggregates are detected under fluorescence microscopy. A similar strategy can be employed to identify cargos of other motor proteins.

تحديد كينيسين-1 الشحنات عن طريق الميكروسكوب الإسفار

Fluorescence microscopy is employed to identify Kinesin-1 cargos. Recently, the heavy chain of Kinesin-1 (KIF5B) was shown to transport the nuclear ...

Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) based readouts of fixed or live cells in multiwell plates. This provides a means to screen for cell signaling processes read out using intramolecular FRET biosensors or intermolecular FRET of protein interactions such as oligomerization or heterodimerization, which can be used to identify binding partners. We describe here the functionality of this automated multiwell plate FLIM instrumentation and present exemplar data from our studies of HIV Gag protein oligomerization and a time course of a FRET biosensor in live cells. A detailed description of the practical implementation is then provided with reference to a list of hardware components and a description of the open source data acquisition software written in &#181;Manager. The application of FLIMfit, an open source MATLAB-based client for the OMERO platform, to analyze arrays of multiwell plate FLIM data is also presented. The protocols for imaging fixed and live cells are outlined and a demonstration of an automated multiwell plate FLIM experiment using cells expressing fluorescent protein-based FRET constructs is presented. This is complemented by a walk-through of the data analysis for this specific FLIM FRET data set.

We present an open source high content analysis (HCA) instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) based readouts. Data acquisition for this openFLIM-HCA instrument is controlled by software written in &#181;Manager and data analysis is undertaken in FLIMfit.

المصدر المفتوح تحليل عالية المحتوى الاستفادة الآلي الإسفار مدى الحياة التصوير المجهري

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions ...

Lens-free Video Microscopy for the Dynamic and Quantitative Analysis of Adherent Cell Culture

Here, we demonstrate that lens-free video microscopy enables us to simultaneously capture the kinetics of thousands of cells directly inside the incubator and that it is possible to monitor and quantify single cells along several cell cycles. We describe the full protocol used to monitor and quantify a HeLa cell culture for 2.7 days. First, cell culture acquisition is performed with a lens-free video microscope, and then the data is analyzed following a four-step process: multi-wavelength holographic reconstruction, cell-tracking, cell segmentation and cell division detection algorithms. As a result, we show that it is possible to gather a dataset featuring more than 10,000 cell cycle tracks and more than 2 x 106 cell morphological measurements.

Lens-free video microscopy enables us to monitor cell cultures directly inside the incubator. Here we describe the full protocol used to acquire and analyze a 2.7 day long acquisition of cultured HeLa cells, leading to a dataset of 2.2 x 106 measurements of individual cell morphology and 10584 cell cycle tracks.

الفيديو خالية من عدسة مجهرية للدينامية والتحليل الكمي للثقافة الخلية ملتصقة

Here, we demonstrate that lens-free video microscopy enables us to simultaneously capture the kinetics of thousands of cells directly inside the incubator ...