我们感谢纳丁Wambsganss，优良的技术援助。通过CAG创新基金FRONTIER（海德堡大学）的资助，这项工作是由授出德意志研究联合会（GL599/1-1）和部分支持

1。协议<ol><li>准备缓冲器，如下所示： <ol><li>准备缓冲对PBMC隔离：“洗净缓冲区”= 0.02％EDTA在PBS（使用0.5 M EDTA）。 </li><li>准备的缓冲液单核细胞的分离：“MACS漂洗缓冲液”= 0.5％BSA（250毫克）+ 2mM的EDTA（200微升）+ PBS（50ml）中。脱气缓冲液中。 </li><li>准备缓冲FACS染色和存储单元：“流式细胞仪缓冲”= 10％FCS的PBS和“固定缓冲区”= 1％PFA固定。 </li></ol></li><li>从前臂静脉绘制30毫升全血。使用EDTA抗凝。 </li><li>隔离如下（PBMC HISTOPAQUE）： <ol><li>准备两个无菌的50毫升管（聚苯乙烯）。 </li><li>从第2步用PBS 1:1稀释血液。 </li><li>加入25毫升HISTOPAQUE的每管25毫升全血/ PBS。 ，确保HISTOPAQUE和血液不混合。 </li><li>以400×g离心30分钟，在室温下，不加制动。 </li><li>吸血浆和丢弃。 </li><li>吸不透明接口和吸管成清洁50毫升浴缸Ê。 </li><li>加入20毫升0.02％EDTA在PBS中。 </li><li>在4℃下离心5分钟，在250×g离心</li><li>弃上清。 </li><li>加入10毫升0.02％EDTA在PBS中。 </li></ol></li><li>计数细胞，如下所示： <ol><li>涡旋10秒拌匀。 </li><li>取200微升细胞悬液+ 300微升0.02％EDTA在PBS + 500微升台盼蓝（200-500 cells/10广场，否则改变稀释倍数）。 </li></ol></li><li>执行如下的单核细胞的负隔离： <ol><li>在步骤3.10中获得的细胞10分钟，120×g下离心。弃上清。 </li><li>通过加入10毫升的PBS + 0.02％EDTA和10分钟，120×g下离心洗涤细胞沉淀2倍。 </li><li>加入9毫升无菌水，持续3秒，加入1 ml 10X PBS。 </li><li>用PBS + 0.02％EDTA洗一次，离心10分钟，120 X G。 </li><li>伯爵在离心过程中。 </li><li> ，在EasySep缓冲液稀释，以5×10 7个/ ml。 </li><li>添加50μL/毫升的单核细胞富集公鸡尾巴。 </li><li>孵育10分钟，在4℃下</li><li>旋涡有孔玻璃珠，持续30秒。 </li><li>加入50微升/毫升的有孔玻璃珠。 </li><li>孵育5分钟，在4℃下</li><li> EasySep缓冲区填写完成量为2.5毫升。现在的解决方案出现褐色。 </li><li>放入磁铁。 </li><li>在室温下等待2.5分钟。在这段时间内将移动到管壁非单核细胞磁珠结合，并坚持在那里。 </li><li>新鲜的无菌试管中倒入缓冲液不具约束力的单核细胞。这个解决方案看起来发白。 </li><li>用PBS + 0.02％EDTA洗一次，10分钟，120×g下离心。 </li></ol></li><li>板在塑料盘或多层盘的密度为0.5×10 6个/ cm 2的细胞。加入1 ml的培养基/ 1×10 6个细胞。 </li><li>利益的条件下培养细胞为6-14天。 </li><li>更换介质后3天更换50％的媒体与新媒体（ 见表1）。 </li><li>经过6天收获细胞mRNA分离，流式细胞仪，免疫印迹法等 。 </li></ol>

<ol>
	<li>Gordon, S., Taylor, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte+and+macrophage+heterogeneity.">Monocyte and macrophage heterogeneity.</a> Nat. Rev. Immunol. 5, 953-964 (2005).</li><li>Gordon, S., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+and+plasticity+of+mononuclear+phagocytes.">Diversity and plasticity of mononuclear phagocytes.</a> European Journal of Immunology. 41, 2470-2472 (2011).</li><li>Martinez, F. O., Sica, A., Mantovani, A., Locati, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+activation+and+polarization.">Macrophage activation and polarization.</a> Front. Biosci. 13, 453-461 (2008).</li><li>Ingersoll, M. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+intraplaque+hemorrhage+evokes+a+novel+atheroprotective+macrophage+phenotype.">Coronary intraplaque hemorrhage evokes a novel atheroprotective macrophage phenotype.</a> American Journal of Pathology. 174, 1097-1108 (2009).</li><li>Cho, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+dendritic+cell-like+phenotype+in+macrophages+during+foam+cell+formation.">Induction of dendritic cell-like phenotype in macrophages during foam cell formation.</a> Physiol Genomics. 29, 149-160 (2007).</li><li>Vogt, G., Nathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+differentiation+of+human+macrophages+with+enhanced+antimycobacterial+activity.">In vitro differentiation of human macrophages with enhanced antimycobacterial activity.</a> The Journal of Clinical Investigation. 121, 3889-3901 (2011).</li><li>Mikita, T., Porter, G., Lawn, R. M., Shiffman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidized+low+density+lipoprotein+exposure+alters+the+transcriptional+response+of+macrophages+to+inflammatory+stimulus.">Oxidized low density lipoprotein exposure alters the transcriptional response of macrophages to inflammatory stimulus.</a> Journal of Biological Chemistry. 276, 45729-45739 (2001).</li><li>Qin, Z. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+THP-1+cells+as+a+model+for+mimicking+the+function+and+regulation+of+monocytes+and+macrophages+in+the+vasculature.">The use of THP-1 cells as a model for mimicking the function and regulation of monocytes and macrophages in the vasculature.</a> Atherosclerosis. 221, 2-11 (2012).</li><li>Daigneault, M., Preston, J. A., Marriott, H. M., Whyte, M. K. B., Dockrell, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+identification+of+markers+of+macrophage+differentiation+in+pma-stimulated+THP-1+cells+and+monocyte-derived+macrophages.">The identification of markers of macrophage differentiation in pma-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages.</a> PLoS One. 5, e8668 (2010).</li><li>Wahl, L. M., Wahl, S. M., Smythies, L. E., Smith, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+human+monocyte+populations.">Isolation of human monocyte populations.</a> Current Protocols in Immunology. , (2001).</li><li>Waldo, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+human+macrophages+in+culture+and+in+atherosclerotic+plaques.">Heterogeneity of human macrophages in culture and in atherosclerotic plaques.</a> Am. J. Pathol. 172, 1112-1126 (2008).</li><li>Mart&#237;n-Fuentes, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Individual+variation+of+scavenger+receptor+expression+in+human+macrophages+with+oxidized+low-density+lipoprotein+is+associated+with+a+differential+inflammatory+response.">Individual variation of scavenger receptor expression in human macrophages with oxidized low-density lipoprotein is associated with a differential inflammatory response.</a> The Journal of Immunology. 179, 3242-3248 (2007).</li></ol>

作者没有透露任何利益冲突。

单核细胞源性巨噬细胞的先天免疫系统的主要细胞类型的代表。他们发挥了重要的作用，在许多炎症性疾病，包括动脉粥样硬化或癌症2。因此，巨噬细胞的生物学研究是必不可少的许多疾病的病理生理学增加我们的知识，并允许开发新的疗法。 许多研究应用小鼠模型的过度表达或缺乏某些基因的利益。在单核细胞源性巨噬细胞的情况下，这似乎不是最好的方法来研?...

单核细胞源性巨噬细胞的一个重要的先天免疫系统的细胞成分和向许多急性或慢性的炎症过程1。巨噬细胞发挥 ​​了重要作用，在许多炎症性疾病，如动脉粥样硬化或癌症2。巨噬细胞表现出高度的可塑性，能够承担不同的表型，这取决于在当地micromilieu 3。因此，巨噬细胞分化和异质性研究是必不可少的许多疾病的病理生理增加我们的知识，并让新的治疗靶点的识别和开发新的疗法。 在许多情况下，小鼠模型用于研究特定疾病的病理生理学。然而，使用小鼠模型研究巨噬细胞生物学是伴随着一些缺点：（1）白细胞子集数的比例（ 即单核细胞和粒细胞）在侏罗纪大庆外围的老鼠或人类的血液显著不同建议单核细胞在小鼠和人类生理的不同角色。 （2）建议实质性的差异，它们的功能在健康和疾病4的小鼠和人类外周血单核细胞之间的基因表达有很大差异。 （3）数的标记，用来识别小鼠单核细胞和巨噬细胞（F4/80，LYC 等 ），人类髓系细胞中不存在，使转移的小鼠模型中的结果的人的情况，而难以。 因此，为了提高我们的理解在人类疾病中的巨噬细胞分化和异质性，我们需要利用模型与人类巨噬细胞。因此，我们在这里描述的模型人原发性巨噬细胞产生的，并且容易使用，并允许在各种条件下产生的在不同的巨噬细胞婆的人单核细胞源性巨噬细胞的体外研究偏振类型。在几项研究中，我们已经使用了单核细胞衍生的原代人巨噬细胞的体外模型分析巨噬细胞生物学和其潜在的相关人类动脉粥样硬化5-7。 即使不能完全代替实验动物或人体组织获得验尸 ，这里所描述的模型允许疾病可能是高度相关的各种人类疾病的机制和治疗靶点的识别和验证。

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml centrifuge tube (sterile)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>055398</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS (1X), liquid (no calcium or magnesium)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14190-250</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9285</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-8806</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Human Monocyte Enrichment Kit</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>19059</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Magnet</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>18000</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>352008</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macrophage-SFM (1X)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12065-074</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-4458</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutridoma-SP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11011375001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human M-CSF 10 &mu;g</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-25</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Plates 6-well</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>07-200-80</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro model to study heterogeneity of human macrophage differentiation and polarization

单核细胞源性巨噬细胞的一个重要的先天免疫系统的细胞不同的。遭受巨噬细胞生物学研究的小鼠模型小鼠和人类之间的单核细胞源性巨噬细胞的表型和功能的差异。因此，我们在这里描述的生成和学习初级人类巨噬细胞的体外模型。简言之，密度梯度离心，从前臂静脉抽血周后，单核细胞分离出外周血单核细胞，使用负磁珠隔离。在这些单核细胞，然后在特定的条件下培养6天后，诱导巨噬细胞的分化或极化的不同类型的。该模型是易于使用和规避鼠标和男人之间的种属特异性的差异所造成的问题。此外，它更接近体内条件比永生化细胞系的使用。最后，这里所描述的模型适合研究巨噬细胞ê生物学，找出疾病的机制和新的治疗靶点。即使不能完全代替实验动物或人体组织获得验尸 ，这里所描述的模型允许疾病可能是高度相关的各种人类疾病的机制和治疗靶点的识别和验证。

通过上述协议，我们经常得到25.1×10 6±2.2×10 6 monocytes/100关于毫升血（平均值±标准差从26个独立的实验， 图1A）。经常由流式细胞仪染色CD14是单核细胞纯度大于95％（97.1±0.4％，平均值±标准误差由3个独立的实验中， 图1B）。新鲜分离的单核细胞，用台盼蓝染色测定细胞存活率大于95％（数据未示出）是常规。虽然最初细胞呈圆形和浮动，他们通常会开始坚持的?...

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An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

单核细胞源性巨噬细胞是先天免疫系统的重要细胞。这里，我们描述一个易于使用的<em&gt;在体外</em&gt;模型来生成这些细胞。使用梯度离心法，负胎圈分离和特定的细胞培养条件，可以产生单核细胞源性巨噬细胞表型和功能的研究。

一个<em在体外</em&gt;模型研究人类巨噬细胞分化和极化的异质性

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

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Immunology and Infection

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

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