אנו מודים Wambsganss נאדין לקבלת סיוע טכני מעולה. עבודה זו נתמכה על ידי מענק מטעם Forschungsgemeinschaft דויטשה (GL599/1-1) ובחלקו על ידי מענק מקרן חדשנות הגבול (אוניברסיטת היידלברג) לחטיבה

1. פרוטוקול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חוצצים כדלקמן: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את החיץ לבידוד PBMC: &quot;לשטוף חיץ&quot; = 0.02% EDTA ב PBS (שימוש 0.5 M EDTA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את החיץ לבידוד מונוציטים: &quot;חיץ שטיפת מקינטוש&quot; = 0.5% BSA (250 מ&quot;ג) + 2 מ&quot;מ EDTA (200 μl) + PBS (50 מ&quot;ל). דגה החיץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את החיץ מכתים FACS ואחסון של תאים: &quot;FACS חיץ&quot; = 10% FCS ב PBS ו&quot; חיץ קיבעון &quot;= 1% PFA ב PBS. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צייר דם כל 30 מ&quot;ל מוריד בזרוע. השתמש EDTA כנוגד קרישה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד PBMC (Histopaque) כדלקמן: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן שני צינורות 50 מ&quot;ל סטרילי (לא פולי-סטירן). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל דם משלב 2 עם PBS 1:1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף מיליליטר Histopaque 25 + 25 מיליליטר דם מלא / PBS לכל צינור. ודא כי Histopaque ודם לא מתערבבים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב XG 400 עבור 30 דקות ב RT, לא בלם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב פלזמה וזורקת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב ממשק אטום וטפטף לתוך אמבטיה הנקי 50 מ&quot;לדואר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20 מ&quot;ל של 0.02% EDTA ב-PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב XG 250 במשך 5 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 מ&quot;ל של 0.02% EDTA ב-PBS. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים באופן הבא: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים היטב על ידי vortexing עבור 10 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 200 השעיה μl תא + 300 μl 0.02% EDTA ב PBS + 500 μl של Trypan כחול (200-500 cells/10 ריבועים, אחרת לשנות גורם לדילול). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע בידוד שלילי של מונוציטים כדלקמן: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה תאים המתקבלים בשלב 3.10 עבור 10 דקות, 120 x גרם. בטל supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תא גלולה 2x על ידי הוספת 10 מ&quot;ל של PBS + 0.02% EDTA ו צנטריפוגות במשך 10 דקות, 120 x גרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 9 מיליליטר מים סטריליים ל3 שניות, להוסיף 1 מ&quot;ל PBS 10X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף פעם נוספת עם PBS + 0.02% EDTA וצנטריפוגות 10 דקות, 120 x גרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסמוך במהלך צנטריפוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל במאגר EasySep ב5 x 10 7 / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 זין העשרת מונוציטים μl / מ&quot;לזנב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה במשך 10 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חרוזים מערבולת למשך 30 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 חרוזים μl / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה במשך 5 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתמלא בחיץ EasySep כדי להשלים נפח של 2.5 מ&quot;ל. הפתרון עכשיו מופיע חום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכניס לתוך מגנט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חכה 2.5 דקות ב RT. במהלך הזמן הזה התאים שאינם monocytic המאוגדים חרוז המגנטי יעברו לקיר הצינור ולתקוע שם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים חיץ עם מונוציטים בלתי מחייבים לתוך צינור סטרילי טרי. פתרון זה נראה לבנבן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפי פעם עם PBS + 0.02% EDTA ו צנטריפוגות במשך 10 דקות, 120 x גרם. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט תאים בצלחת פלסטיק או multiwall צלחת בצפיפות של 0.5 x 10 6/2 ס&quot;מ. הוסף 1 מ&quot;ל של תקשורת בתרבות / 1 x 10 6 תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות תאים בתנאים של ריבית עבור 6-14 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שינוי תקשורת לאחר 3 ימים על ידי החלפת 50% מהתקשורת עם תקשורת טרי (ראה טבלת מס &#39;1 לפרטים נוספים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">לאחר שישה ימים לתאי קציר בידוד mRNA, cytometry הזרימה, מערבי סופג, וכו &#39;. </li></ol>

<ol>
	<li>Gordon, S., Taylor, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte+and+macrophage+heterogeneity.">Monocyte and macrophage heterogeneity.</a> Nat. Rev. Immunol. 5, 953-964 (2005).</li><li>Gordon, S., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+and+plasticity+of+mononuclear+phagocytes.">Diversity and plasticity of mononuclear phagocytes.</a> European Journal of Immunology. 41, 2470-2472 (2011).</li><li>Martinez, F. O., Sica, A., Mantovani, A., Locati, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+activation+and+polarization.">Macrophage activation and polarization.</a> Front. Biosci. 13, 453-461 (2008).</li><li>Ingersoll, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+gene+expression+profiles+between+human+and+mouse+monocyte+subsets.">Comparison of gene expression profiles between human and mouse monocyte subsets.</a> Blood. 115, 10-19 (2010).</li><li>Gleissner, C. A., Sanders, J. M., Nadler, J., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upregulation+of+aldose+reductase+during+foam+cell+formation+as+possible+link+among+diabetes,+hyperlipidemia,+and+atherosclerosis.">Upregulation of aldose reductase during foam cell formation as possible link among diabetes, hyperlipidemia, and atherosclerosis.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 28, 1137-1143 (2008).</li><li>Gleissner, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXCL4+downregulates+the+atheroprotective+hemoglobin+receptor+CD163+in+human+macrophages.">CXCL4 downregulates the atheroprotective hemoglobin receptor CD163 in human macrophages.</a> Circ. Res. , (2009).</li><li>Gleissner, C. A., Shaked, I., Little, K. M., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXC+chemokine+ligand+4+induces+a+unique+transcriptome+in+monocyte-derived+macrophages.">CXC chemokine ligand 4 induces a unique transcriptome in monocyte-derived macrophages.</a> J. Immunol. 184, 4810-4818 (2010).</li><li>Martinez, F. O., Gordon, S., Locati, M., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+profiling+of+the+human+monocyte-to-macrophage+differentiation+and+polarization:+New+molecules+and+patterns+of+gene+expression.">Transcriptional profiling of the human monocyte-to-macrophage differentiation and polarization: New molecules and patterns of gene expression.</a> J. Immunol. 177, 7303-7311 (2006).</li><li>Verreck, F. A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+il-23-producing+type+1+macrophages+promote+but+il-10-producing+type+2+macrophages+subvert+immunity+to+(myco)bacteria.">Human il-23-producing type 1 macrophages promote but il-10-producing type 2 macrophages subvert immunity to (myco)bacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 4560-4565 (2004).</li><li>Rey-Giraud, F., Hafner, M., Ries, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+generation+of+monocyte-derived+macrophages+under+serum-free+conditions+improves+their+tumor+promoting+functions.">In vitro generation of monocyte-derived macrophages under serum-free conditions improves their tumor promoting functions.</a> PLoS One. 7, e42656 (2012).</li><li>Boyle, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+intraplaque+hemorrhage+evokes+a+novel+atheroprotective+macrophage+phenotype.">Coronary intraplaque hemorrhage evokes a novel atheroprotective macrophage phenotype.</a> American Journal of Pathology. 174, 1097-1108 (2009).</li><li>Cho, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+dendritic+cell-like+phenotype+in+macrophages+during+foam+cell+formation.">Induction of dendritic cell-like phenotype in macrophages during foam cell formation.</a> Physiol Genomics. 29, 149-160 (2007).</li><li>Vogt, G., Nathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+differentiation+of+human+macrophages+with+enhanced+antimycobacterial+activity.">In vitro differentiation of human macrophages with enhanced antimycobacterial activity.</a> The Journal of Clinical Investigation. 121, 3889-3901 (2011).</li><li>Mikita, T., Porter, G., Lawn, R. M., Shiffman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidized+low+density+lipoprotein+exposure+alters+the+transcriptional+response+of+macrophages+to+inflammatory+stimulus.">Oxidized low density lipoprotein exposure alters the transcriptional response of macrophages to inflammatory stimulus.</a> Journal of Biological Chemistry. 276, 45729-45739 (2001).</li><li>Qin, Z. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+THP-1+cells+as+a+model+for+mimicking+the+function+and+regulation+of+monocytes+and+macrophages+in+the+vasculature.">The use of THP-1 cells as a model for mimicking the function and regulation of monocytes and macrophages in the vasculature.</a> Atherosclerosis. 221, 2-11 (2012).</li><li>Daigneault, M., Preston, J. A., Marriott, H. M., Whyte, M. K. B., Dockrell, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+identification+of+markers+of+macrophage+differentiation+in+pma-stimulated+THP-1+cells+and+monocyte-derived+macrophages.">The identification of markers of macrophage differentiation in pma-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages.</a> PLoS One. 5, e8668 (2010).</li><li>Wahl, L. M., Wahl, S. M., Smythies, L. E., Smith, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+human+monocyte+populations.">Isolation of human monocyte populations.</a> Current Protocols in Immunology. , (2001).</li><li>Waldo, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+human+macrophages+in+culture+and+in+atherosclerotic+plaques.">Heterogeneity of human macrophages in culture and in atherosclerotic plaques.</a> Am. J. Pathol. 172, 1112-1126 (2008).</li><li>Mart&#237;n-Fuentes, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Individual+variation+of+scavenger+receptor+expression+in+human+macrophages+with+oxidized+low-density+lipoprotein+is+associated+with+a+differential+inflammatory+response.">Individual variation of scavenger receptor expression in human macrophages with oxidized low-density lipoprotein is associated with a differential inflammatory response.</a> The Journal of Immunology. 179, 3242-3248 (2007).</li></ol>

המחברים לא צריכים לחשוף כל ניגוד עניינים.

מקרופאגים מונוציטים הנגזרות מייצגים את סוג התא המרכזי של מערכת החיסון המולדת. הם משחקים תפקיד חשוב במחלות דלקתיות רבות, כולל טרשת עורקים או סרטן 2. לפיכך, לומד ביולוגיה מקרופאג הוא חיוני להעמקת הידע שלנו על הפתופיזיולוגיה של מחלות רבות ולאפשר פיתוח של טיפולים ח...

מקרופאגים מונוציטים הנגזרות מייצגים מרכיב תאי חשוב של מערכת החיסון המולדת ולתרום לתהליכים דלקתיים רבים 1 אקוטיים או כרוניים. המקרופאגים משחקים תפקיד חשוב במחלות דלקתיות כמו טרשת עורקים רבות או סרטן 2. המקרופאגים מראים רמה גבוהה של גמישות והם מסוגלים להניח פנוטיפים שונים בהתאם לmicromilieu המקומי 3. לפיכך, לומד בידול מקרופאג וההטרוגניות הוא חיוני להגדלת הידע של הפתופיזיולוגיה של מחלות רבות שלנו ועל מנת לאפשר זיהוי מטרות טיפוליות חדשניות ופיתוח של טיפולים חדשניים. במקרים רבים, מודלים Murine משמשים כדי לחקור את הפתופיזיולוגיה של מחלות ספציפיות. עם זאת, לומד ביולוגיה מקרופאג באמצעות מודלים עכבר מלווה בכמה חסרונות: (1) חלקם של מספרי קבוצת משנה ויקוציטים (מונוציטים וגרנולוציטים כלומר) בperipדם heral של עכברים או בני אדם שונה באופן משמעותי המצביע על תפקידים שונים של מונוציטים בפתופיזיולוגיה עכברית ואנושית. (2) יש הבדלים משמעותיים בביטוי גנים בין מונוציטים בדם היקפיים Murine והאנושיים המצביעים על הבדלים משמעותיים בתפקודם במהלך מחלה ובריאות 4. (3) מספר הסמנים המשמשים לזיהוי מונוציטים ומקרופגים (F4/80, LYC, וכו &#39;.) עכבריים אינה קיימים בתאי מיאלואידית אדם, מה שהופך את העברת ממצאים במודלים של עכבר למצב האנושי קשה למדי. לכן, על מנת להגביר את ההבנה של בידול מקרופאג וההטרוגניות במחלה אנושית שלנו, אנחנו צריכים לעשות שימוש במודלים שעובדים עם מקרופאגים אדם. לכן, לנו כאן לתאר מודל של דור מקרופאג העיקרי אדם כי הוא קל לשימוש ומאפשר לימוד של מקרופאגים מונוציטים הנגזרות אדם במבחנה בתנאים שונים וכתוצאה מכך שונה מקרופאג פוסוגי larization. במספר מחקרים, יש לנו להשתמש במודל חוץ גופית של מקרופאגים האנושיים העיקריים מונוציטים הנגזרות לנתח ביולוגיה מקרופאג ואת הרלוונטיות שלה לטרשת עורקת פוטנציאל אנושית 5-7. למרות שאינך מחליף באופן מלא ניסויים עם בעלי חיים או רקמות אדם שנלקחו לאחר מוות, המודל שתואר כאן מאפשר זיהוי ואימות של מנגנוני מחלה ומטרות טיפוליות שעשויות להיות רלוונטיות מאוד למחלות אנושיות שונות.

<table><tbody><tr><td>50 ml centrifuge tube (sterile)</td><td>Fisher</td><td>055398</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS (1X), liquid (no calcium or magnesium)</td><td>Invitrogen</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>T9285</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A-8806</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EasySep Human Monocyte Enrichment Kit</td><td>StemCell Technologies</td><td>19059</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Magnet</td><td>StemCell Technologies</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>FACS tubes</td><td>Fisher</td><td>352008</td><td></td></tr><tr><td>Macrophage-SFM (1X)</td><td>Invitrogen</td><td>12065-074</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin</td><td>Sigma</td><td>P-4458</td><td></td></tr><tr><td>Nutridoma-SP</td><td>Roche</td><td>11011375001</td><td></td></tr><tr><td>human M-CSF 10 &amp;mu;g</td><td>Peprotech</td><td>300-25</td><td></td></tr><tr><td>Cell Culture Plates 6-well</td><td>Fisher</td><td>07-200-80</td><td></td></tr></tbody></table>

an in vitro model to study heterogeneity of human macrophage differentiation and polarization

מקרופאגים מונוציטים הנגזרות מייצגים סוג תא חשוב של מערכת החיסון המולדת. מודלים עכבר הלומדים ביולוגיה מקרופאג סובלים מההבדלים פנוטיפי ופונקציונליים בין מקרופאגים מונוציטים הנגזרות Murine והאנושיים. לכן, לנו כאן לתאר במודל חוץ גופית כדי ליצור וללמוד מקרופאגים האנושיים העיקריים. בקצרה, לאחר צנטריפוגה שיפוע הצפיפות של דם היקפי נמשך מוריד בזרוע, מונוציטים מבודדים מתאי דם היקפיים mononuclear באמצעות בידוד חרוז מגנטי שלילי. מונוציטים אלה בתרבית, במשך שישה ימים בתנאים מסוימים לגרום לסוגים שונים של בידול מקרופאג או קיטוב. המודל הוא קל לשימוש ועוקף את הבעיות שנגרמו על ידי הבדלים בין מינים ספציפי עכבר ואדם. יתר על כן, הוא קרוב יותר לתנאים בvivo מאשר השימוש בשורות תאים הונצחו. לסיכום, המודל שתואר כאן הוא מתאים ללמוד macrophagביולוגיה דואר, לזהות מנגנוני מחלה ומטרות טיפוליות חדשניות. למרות שאינך מחליף באופן מלא ניסויים עם בעלי חיים או רקמות אדם שנלקחו לאחר מוות, המודל שתואר כאן מאפשר זיהוי ואימות של מנגנוני מחלה ומטרות טיפוליות שעשויות להיות רלוונטיות מאוד למחלות אנושיות שונות.

באמצעות הפרוטוקול שתואר לעיל, באופן שגרתי אנחנו להשיג 25.1 דם x 10 6 ± 2.2 x 10 6 monocytes/100 מ&quot;ל (שגיאה ממוצעת ± סטנדרטי מ -26 ניסויים בלתי תלויים, איור 1 א). טוהר מונוציטים כפי שנקבע על ידי צביעת תזרים cytometric לCD14 הוא באופן שגרתי יותר מ -95% (97.1 ± 0.4%, סטיית תקן ממוצע...

Watch this Scientific Journal Video about An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization at JoVE.com

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

מקרופאגים הנגזרות מונוציטים הם תאים חשובים של מערכת החיסון המולדת. כאן, אנו מתארים קלים לשימוש<em&gt; במבחנה</em&gt; מודל ליצירת תאים אלה. השימוש בצנטריפוגה שיפוע, בידוד חרוז שלילי ותנאי תרבות תאים מסוימים, יכולים להיות שנוצרו מקרופאגים מונוציטים הנגזרות ללימודים פנוטיפי ופונקציונליים.

<em&gt; במבחנה</em&gt; מודל ללמוד ההטרוגניות של בידול Macrophage אדם וקיטוב

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

an-vitro-model-to-study-heterogeneity-human-macrophage

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

18.6K Views.  University of Heidelberg. מקרופאגים הנגזרות מונוציטים הם תאים חשובים של מערכת החיסון המולדת. כאן, אנו מתארים קלים לשימוש במבחנה מודל ליצירת תאים אלה. השימוש בצנטריפוגה שיפוע, בידוד חרוז שלילי ותנאי תרבות תאים מסוימים, יכולים להיות שנוצרו מקרופאגים מונוציטים הנגזרות ללימודים פנ?...

Video: An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Proteomic Analysis of Human Macrophage Polarization Under a Low Oxygen Environment

Macrophages are innate immune cells involved in a number of physiological functions ranging from responses to infectious pathogens to tissue homeostasis. The various functions of these cells are related to their activation states, which is also called polarization. The precise molecular description of these various polarizations is a priority in the field of macrophage biology. It is currently acknowledged that a multidimensional approach is necessary to describe how polarization is controlled by environmental signals. In this report, we describe a protocol designed to obtain the proteomic signature of various polarizations in human macrophages. This protocol is based on a label-free quantification of macrophage protein expression obtained from in-gel fractionated and Lys C/trypsin-digested cellular lysis content. We also provide a protocol based on in-solution digestion and isoelectric focusing fractionation to use as an alternative. Because oxygen concentration is a relevant environmental parameter in tissues, we use this protocol to explore how atmospheric composition or a low oxygen environment affects the classification of macrophage polarization.

We present a protocol to obtain proteomic signatures of human macrophages and apply this to determination of the impact of a low oxygen environment on macrophage polarization.

ניתוח פרוטיאומיה מבנית של קיטוב מקרופאג האנושי תחת סביבה חמצן נמוך

Macrophages are innate immune cells involved in a number of physiological functions ranging from responses to infectious pathogens to tissue homeostasis. ...

Biochemistry

Investigation of Macrophage Polarization Using Bone Marrow Derived Macrophages

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic stem/progenitor cells from the bone marrow are directed into monocytic differentiation, followed by M1 or M2 stimulation. The activation status can be tracked by changes in cell surface antigens, gene expression and cell signaling pathways.

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic stem/progenitor cells from the bone marrow are directed into monocytic differentiation, followed by M1 or M2 stimulation. The activation status can be tracked by changes in cell surface antigens, gene expression and cell signaling pathways.

חקירה של קיטוב Macrophage שימוש המקרופאגים נגזרים מח עצם

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic ...

Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to understand the underlying mechanisms of these diseases. We therefore present a straightforward protocol for the isolation of human monocytes from buffy coats, followed by a differentiation procedure which results in high macrophage yields. The technique relies mostly on commonly available lab equipment and thus provides a cost and time effective way to obtain large quantities of human macrophages. Briefly, buffy coats from healthy blood donors are subjected to a double density gradient centrifugation to harvest monocytes from the peripheral blood. These monocytes are then cultured in fluorinated ethylene propylene (FEP) Teflon-coated cell culture bags in the presence of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF). The differentiated macrophages can be easily harvested and used for subsequent studies and functional assays. Important methods for quality control and validation of the isolation and differentiation steps will be highlighted within the protocol. In summary, the protocol described here enables scientists to routinely and reproducibly isolate human macrophages without the need for cost intensive tools. Furthermore, disease models can be studied in a syngeneic human system circumventing the use of murine macrophages.

We present a simple and efficient protocol for the generation of human macrophages. Buffy coats are processed by double density gradient centrifugation and isolated monocytes are then differentiated to macrophages in Teflon-coated cell culture bags. This maximizes macrophage yields and facilitates cell harvesting for subsequent experiments.

בידוד של אדם מונוציטים ידי זוגי Gradient צנטריפוגה והבידול שלהם להמקרופאגים בתיקי תרבית תאים מצופים טפלון

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation of experiments, fresh or frozen monocytes are cultured in flasks for 1 week with M-CSF to induce their differentiation into macrophages. Then, the macrophages can be harvested and seeded into culture wells at required cell densities for carrying out experiments. The use of defined numbers of macrophages rather than defined numbers of monocytes to initiate macrophage cultures for experiments yields macrophage cultures in which the desired cell density can be more consistently attained. Use of cryopreserved monocytes reduces dependency on donor availability and produces more homogeneous macrophage cultures.

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. The protocol utilizes cryopreservation of monocytes coupled with their bulk differentiation into macrophages. Then harvested macrophages can then be seeded into culture wells at required cell densities for carrying out experiments.

תרבות של Macrophage מושבה מגרה פקטור בדיל אדם המקרופאגים מונוציטים הנגזר

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

In Vitro Stimulation and Visualization of Extracellular Trap Release in Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

The release of extracellular traps (ETs) by neutrophils has been identified as a contributing factor to the development of diseases related to chronic inflammation. Neutrophil ETs (NETs) consist of a mesh of DNA, histone proteins, and various granule proteins (i.e., myeloperoxidase, elastase, and cathepsin G). Other immune cells, including macrophages, can also produce ETs; however, to what extent this occurs in vivo and whether macrophage extracellular traps (METs) play a role in pathological mechanisms has not been examined in detail. To better understand the role of METs in inflammatory pathologies, a protocol was developed for visualizing MET release from primary human macrophages in vitro, which can also be exploited in immunofluorescence experiments. This allows further characterization of these structures and their comparison to ETs released from neutrophils. Human monocyte-derived macrophages (HMDM) produce METs upon exposure to different inflammatory stimuli following differentiation to the M1 pro-inflammatory phenotype. The release of METs can be visualized by microscopy using a green fluorescent nucleic acid stain that is impermeant to live cells (e.g., SYTOX green). Use of freshly isolated primary macrophages, such as HMDM, is advantageous in modeling in vivo inflammatory events that are relevant to potential clinical applications. This protocol can also be used to study MET release from human monocyte cell lines (e.g., THP-1) following differentiation into macrophages with phorbol myristate acetate or other macrophage cell lines (e.g., the murine macrophage-like J774A.1 cells).

Presented here is a protocol to detect macrophage extracellular trap (MET) production in live cell culture using microscopy and fluorescence staining. This protocol can be further extended to examine specific MET protein markers by immunofluorescence staining.

בגירוי חוץ-גופית והדמיה של שחרור מלכודת השמנה ב הבדיל מונוקרוציט האדם הנגזר

The release of extracellular traps (ETs) by neutrophils has been identified as a contributing factor to the development of diseases related to chronic ...

Polarization of M1 and M2 Human Monocyte-Derived Cells and Analysis with Flow Cytometry upon Mycobacterium tuberculosis Infection

Human macrophages are primary host cells of intracellular Mycobacterium tuberculosis (Mtb) infection and thus have a central role in immune control of tuberculosis (TB). We have established an experimental protocol to follow immune polarization of myeloid-derived cells into M1 (classically activated) or M2 (alternatively activated) macrophage-like cells through assessment with a 10-color flow cytometry panel that allows visualization and deep-characterization of green-fluorescent-protein (GFP)-labeled Mtb in diverse macrophages subsets. Monocytes obtained from healthy blood donors were polarized into M1 or M2 cells using differentiation with granulocyte macrophage-colony-stimulating factor (GM-CSF) or macrophage-colony stimulating factor (M-CSF) followed by polarization with IFN-&#947; and lipopolysaccharide (LPS) or IL-4, respectively. Fully polarized M1 and M2 cells were infected with Mtb-GFP for 4 hours before detached Mtb-infected macrophages were stained with flow cytometry at 4- or 24-hours post-infection. Sample acquisition was performed with flow cytometry and the data was analyzed using a flow cytometry analysis software. Manual gating as well as dimensionality reduction with Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP) and phenograph analysis was performed. This protocol resulted in effective M1/M2 polarization characterized by elevated levels of CD64, CD86, TLR2, HLA-DR and CCR7 on uninfected M1 cells, while uninfected M2 cells exhibited a strong up-regulation of the M2 phenotype markers CD163, CD200R, CD206 and CD80. M1-polarized cells typically contained fewer bacteria compared to M2-polarized cells. Several M1/M2 markers were downregulated after Mtb infection, which suggests that Mtb can modulate macrophage polarization. In addition, 24 different cell clusters of different sizes were found to be uniquely distributed among the M1 and M2 uninfected and Mtb-infected cells at 24-hours post-infection. This M1/M2 flow cytometry protocol could be used as a backbone in Mtb-macrophage research and be adopted for special needs in different areas of research.

Polarization of M1 and M2 Human Monocyte-Derived Cells and Analysis with Flow Cytometry upon Mycobacterium tuberculosis Infection

This protocol provides a method to study Mycobacterium tuberculosis infection in human M1- or M2-polarized macrophages based on differentiation of peripheral-blood-monocytes to macrophage-like cells that are infected with the GFP-labeled virulent strain H37Rv, and analyzed with flow cytometry using a 10-color panel including expression of selected M1/M2 markers.

קיטוב של M1 ו M2 תאים נגזרים מונוציט אנושי וניתוח עם Cytometry זרימה על זיהום שחפת Mycobacterium

Human macrophages are primary host cells of intracellular Mycobacterium tuberculosis (Mtb) infection and thus have a central role in immune control of ...

Macrophage Differentiation and Polarization into an M2-Like Phenotype using a Human Monocyte-Like THP-1 Leukemia Cell Line

Tumor-associated macrophages (TAM) can switch their expression and cytokine profile according to external stimuli. This remarkable plasticity enables TAM to adapt to ongoing changes within the tumor microenvironment. Macrophages can have either primarily pro-inflammatory (M1-like) or anti-inflammatory (M2-like) attributes and can continually switch between these two main states. M2-like macrophages within the tumor environment are associated with cancer progression and poor prognosis in several types of cancer. Many different methods for inducing differentiation and polarization of THP-1 cells are used to investigate cellular and intercellular mechanisms and the effects of TAM within the microenvironment of tumors. Currently, there is no established model for M2-like macrophage polarization using the THP-1 cell line, and the results of expression and cytokine profiles of macrophages due to certain in vitro stimuli vary between studies. This protocol serves as detailed guidance to differentiate THP-1 monocyte-like cells into M0 macrophages and to further polarize cells into an M2-like phenotype within 14 days. We demonstrate the morphological changes of THP-1 monocyte-like cells, differentiated macrophages, and polarized M2-like macrophages using light microscopy. This model is the basis for cell line models investigating the anti-inflammatory effects of TAM and their interactions with other cell populations of the tumor microenvironment.

M2-like tumor-associated macrophages (TAM) are associated with tumor progression and poor prognosis in cancer. This protocol serves as a detailed guide to reproducibly differentiate and polarize THP-1 monocyte-like cells into M2-like macrophages within 14 days. This model is the basis to investigate the anti-inflammatory effects of TAM within the tumor microenvironment.

בידול מקרופאג' וקיטוב לפנוטיפ דמוי M2 באמצעות קו תאים דמוי THP-1 לוקמיה דמוי מונוציטים

Tumor-associated macrophages (TAM) can switch their expression and cytokine profile according to external stimuli. This remarkable plasticity enables TAM ...

<meta charset="utf8"></head><body>הערכת השפעות אימונומודולטוריות של משטחי שתלים על מקרופאגים

Polarization and Characterization of M1 and M2 Human Monocyte-Derived Macrophages on Implant Surfaces

Foreign body reaction (FBR), an immune-mediated complex healing process, plays a crucial role in integrating implants into the body. Macrophages, as the first line of immune system interaction with implant surfaces, play a bidirectional role in modulating the inflammation-regeneration balance. For a deep understanding and the evaluation of the reactions between implant materials and immune responses, reliable in vitro methods and protocols are pivotal. Among different in vitro models, primary monocyte-derived macrophages (MDMs) present an excellent model for investigating macrophage-implant interactions. We have implemented an experimental protocol to evaluate the polarization of MDMs into M1 (classically activated) and M2 (alternatively activated) macrophages on implant surfaces. We isolated blood monocytes from healthy donors and differentiated them into macrophages using macrophage colony-stimulating factor (M-CSF). Differentiated macrophages were cultured on implant surfaces and polarized into M1 and M2 subtypes. M1 polarization was achieved in the presence of interferon (IFN)-&#947; and lipopolysaccharide (LPS), while M2 polarization was performed in a medium containing interleukin (IL)-4 and IL-13. We evaluated macrophage phenotypes by Enzyme-linked&#160;Immunosorbent Assay (ELISA), confocal laser scanning microscopy (CLSM), and quantitative real-time PCR (qRT-PCR) based on panels of secreted cytokines, cell surface markers, and expressed genes. The extracted RNA was transformed into complementary DNA (cDNA), and qRT-PCR was used to quantify mRNA related to M1 and M2 macrophages. Accordingly, M1 macrophages have been characterized by higher expression of proinflammatory Tumor necrosis factor (TNF-&#945;) cytokine and CCR7 surface marker compared to M2&#160;macrophages, which exhibited higher levels of CD209 and CCL13. Consequently, CCR7 and CD209 were identified as specific and reliable markers of M1 and M2 macrophage subtypes by immunostaining and visualizing by CLSM. Further confirmation was achieved by ELISA detecting elevated TNF-&#593; level in M1 and increased CCL13 in M2 cells. The proposed markers and experimental setup can be used effectively to assess the immunomodulatory potential of implants.

<meta charset="utf8"></head><body>קיטוב ואפיון של מקרופאגים שמקורם במונוציטים אנושיים M1 ו-M2 על משטחי השתל

Here, we present a detailed protocol for assessing the immunomodulatory potential of implant surfaces in vitro, aiming to improve the reliability and reproducibility of current protocols and promoting further research. Secretory cytokine profiles, mRNA expression, and cell surface markers were monitored using blood monocyte-derived macrophages to investigate macrophage polarization cultivated on titanium.

קיטוב ואפיון של מקרופאגים שמקורם במונוציטים אנושיים M1 ו-M2 על משטחי השתל 

Foreign body reaction (FBR), an immune-mediated complex healing process, plays a crucial role in integrating implants into the body. Macrophages, as the ...

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

ניתוח פרוטיאומיה מבנית של קיטוב מקרופאג האנושי תחת סביבה חמצן נמוך

חקירה של קיטוב Macrophage שימוש המקרופאגים נגזרים מח עצם

בידוד של אדם מונוציטים ידי זוגי Gradient צנטריפוגה והבידול שלהם להמקרופאגים בתיקי תרבית תאים מצופים טפלון

תרבות של Macrophage מושבה מגרה פקטור בדיל אדם המקרופאגים מונוציטים הנגזר

בגירוי חוץ-גופית והדמיה של שחרור מלכודת השמנה ב הבדיל מונוקרוציט האדם הנגזר

קיטוב של M1 ו M2 תאים נגזרים מונוציט אנושי וניתוח עם Cytometry זרימה על זיהום שחפת Mycobacterium

בידול מקרופאג' וקיטוב לפנוטיפ דמוי M2 באמצעות קו תאים דמוי THP-1 לוקמיה דמוי מונוציטים

קיטוב ואפיון של מקרופאגים שמקורם במונוציטים אנושיים M1 ו-M2 על משטחי השתל

קיטוב ואפיון של מקרופאגים שמקורם במונוציטים אנושיים M1 ו-M2 על משטחי השתל

קיטוב ואפיון של מקרופאגים שמקורם במונוציטים אנושיים M1 ו-M2 על משטחי השתל