这项工作是由德国研究基金会（德意志研究联合会）资助。

1。制备DNA和玻璃注射微量移液器<ol><li>质量好的玻璃的微量是必不可少的，降低了初始的高流产率，由于羊水流失。已经有据可查的程序拉玻璃微13,18,25。使用直径1.2mm的毛细管拉在常规萨特设定P = 500;热= 300 P-97的移动设备，上拉= 40，速度= 50;时间= 50。适合拉马用3毫米的“药谷”丝（萨特仪器FT330B）。 2毫米大小的细丝已经取得了对我们不太满意的结果。另一方面，坡口的微量提示似乎并没有改善我们的结果。 </li><li>溶解纯化的无内毒素的质粒DNA在PBS中（细胞培养级），含0.1％固绿，以使最终浓度为1〜2微克/微升。快速的绿色会让可见胚胎脑室注射的溶液。 </li><li>装入到玻璃微10μl的DNA溶液。 </lI&gt; <li>玻璃微喷射系统（碧泵）或口吸管连接。 </li></ol> 2。麻醉准备一个加热垫和手术器械的手术表。打开的冷光源，方便的可视化的胚胎。例如使用玻璃珠灭菌消毒外科手术工具。 三种不同的麻醉程序，此协议（见讨论）。在这里，我们将介绍一个我们认为是最好的，使用异氟醚吸入麻醉诱导（流量为0.5升/分钟）以及维护（流量1升/分钟）。 <ol><li>介绍孕鼠在一个透明的小（使鼠标仍然可见）的容器，连接管长度短的科米萨拉夫马克5麻醉设备。 </li><li>填写异氟醚蒸发器，然后打开氧气瓶连接到设备。吹塑一个或两个脉冲isoflurane /按住鼠标和手表昏迷设置英寸到容器中的氧气（0.5升/分钟） </li><li>拿鼠标，它的眼睛用膏干燥，以防止他们在它的头立刻适应流量麻醉面罩。 </li></ol> 3。剖腹探查<ol><li>将鼠标肚皮朝上加热垫（否则体温会下降速度非常快，复苏的机会减少），其四条腿的两侧用胶带固定到位并确保其身体。评估麻醉深度通过检查反射性刺激的反应（ 如脚趾或尾巴捏用力压）损失。 </li><li>剃腹部表面消毒的iodophorpovidone碘（Braunoderm）。 </li><li>腹部皮肤上作一纵切口（1〜1.5厘米长）。然后切开腹膜。将纱布切口周围。一个子宫角可见拉出，到PBS漂洗的gauz的钝钳Ë。用PBS冲洗子宫，很多时候，维持常湿（ 图2A和2B）。在整个过程中，避免的系膜及或子宫拉紧，由于在子宫内的高压力将发送到注射后增加流体损失的机会导致流产胚胎。 </li></ol> 4。 DNA注射到脑室<ol><li>保持子宫在这样一种方式，可以可视化脑室。不要广泛胚胎的位置，是一个不利的位置 - 这样只会增加流产的机会。 </li><li>在胚胎的头部从顶部看，视觉上的间隙或裂缝之间的左，右皮质半球本地化。半球很容易区分，颜色稍深的形状通常可以被视为侧脑室内（不是针对）。如果胚胎被发现是完全面向DNA注射（FIGUR上课2C和2D），可以刺穿子宫壁，并进入第三脑室一次。保持在45°到子宫壁穿刺喙端皮质半球之间的差距，玻璃微穿透约1毫米。在这种方式中的玻璃微吸管的前端进入大脑第三脑室（侧脑室）（ 图2C和2D）。在胚胎逊色导向的，它是有用的第一个捅破子宫壁（总是在45°）在胚胎头附近，将皮质半球之间在正确的位置，然后才枪头刺穿大脑。约1μlDNA溶液注入到第三脑室（一个很好的注射填充绿色液体的脑室）。重复同样的过程，有一个角子宫的胚胎。这使得一段时间的DNA溶液混合均匀，脑室液，达到entirê神经上皮。 </li></ol> 5。针对下丘脑进行电穿孔<ol><li>电穿孔的切换和调整设置，根据胚龄（E12.5我们使用5方波脉冲，50 V，“50毫秒ON/950毫秒关）。使用正极不锈钢针电极（CUY550-10），并作为负极圆扁电极（CUY700P4L）。 （重要的是，电极是小于胚胎，因为否则电流流动的，但不是通过它的胚胎。） </li><li>那些胚胎背侧（ 即转向实验者），因为他们大多是选择电，并丢弃那些方向是不是有利的。现在是安全的乙醇消毒手指或戴手套触摸到子宫。然而，用钳子持有子宫会干扰在电穿孔过程中电流的流动。 </li><li>皮尔斯胚胎的头部子宫壁之间的安姆的iotic囊和胎盘通过它向下推压，与针状电极的尖端。用食指，另一方面作为推力块。现在必须是约5毫米的电极尖端之间的羊膜囊和子宫壁，在大约水平的中脑（ 图2E和2F）。请记住，这是“针对电极”，所以它的位置将决定哪些是最有可能转下丘脑神经上皮的一部分。胚胎有非常温和地电极之间的“挤压”。 </li><li>用另一只手的位置以外的子宫壁胚胎的头（ 图2E与2G）的相对侧上的圆形平板电极。 </li><li>使用脚踏开关施加电压（50 V，50毫秒，950毫秒关，5个方波脉冲）。 </li><li>慢慢拔出针头电极的子宫，而子宫用食指另一方面 - 如果羊膜抽动液体丢失通过刺破壁，通常胚胎发生流产。重复上述步骤，所有的胚胎。 </li><li>返回到腹部和子宫角，残角重复注射和电。 </li></ol> 6。完成手术<ol><li>所有胚胎注射和电后，将子宫放回腹部非常小心，定位，正是因为他们之前和潮湿关闭前用生理盐水腹腔。 </li><li>外科肠线（5-0薇乔的polyglactin 910 V4914），爱惜康缝合腹膜。对于封闭的皮肤使用“打断十字绣”methodwith更耐缝合（6-0 Supramid尼龙，，Serag维斯内尔07171L）。 </li><li>消毒腹部表面用碘伏（Braunoderm）中和注入的非类固醇的抗发炎的皮下（ 例如 Rimadyl 1:10的溶液中加入100μl0.9％NaCl溶液中），或者甚至更好，阿片样物质像蒲式耳prenorphine（Temgesic，0.05〜0.1毫克/公斤体重0.9％氯化钠），以减轻疼痛。 </li><li>母亲从麻醉机移除，并将其放置在一个笼子里这是通过加热垫加热。不断监视鼠标，直到它完全从麻醉中恢复。后来，每天检查的动物，以确保他们正在恢复的过程没有感染或痛苦的任何迹象。 </li></ol> 7。分析结果<ol><li>根据所需的分析当天收获胚胎（或postnatals），。出生后的小鼠（1〜2日龄）断头处死。 </li><li>根据以前的电穿孔注释分隔每个胚胎。大脑解剖立体显微镜下检查，在显微镜下绿色荧光信号（来自GFP记者）在适当的地区。 </li><li> “新鲜”的，可以分析所选择的脑组织固定在4％多聚甲醛和很短的时间在4％琼​​脂糖或明胶一个嵌入lbumin，则第一个vibratome的类型的移动设备上（ 图3）。如需更详细的免疫组化分析（ 图4），低温保护脑嵌入华侨城安装介质（组织TEK）在30％的蔗糖溶液，然后切成20微米的部分在低温恒温器。 </li></ol>

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作者宣称，他们有没有竞争经济利益。

关于麻醉：由于在子宫内的电穿孔进入下丘脑可以在技术上是艰巨而需要较长的昏迷时间，我们优选通过氧和异氟醚的混合物给药麻醉诱导和维持。根据我们的经验，动物可以保持适当的麻醉，在这样的时间长达一个小时，至少，母亲的恢复是非常快的，提高胚胎存活率。其他麻醉方法也可提供。最简单的程序由腹腔注射诱导和维持麻醉状态2.5 0.9毫升/千克体重的氯胺酮（25毫克/毫升），?...

遗传操纵胚胎小鼠大脑是首选的方法，了解发育调控。然而，突变小鼠线的产生是缓慢和昂贵。一个强大的方法来引入特定的基因哺乳动物的大脑发育中神经元的变化是在子宫内的电。本质上，该技术包括DNA转染到胚胎脑的神经上皮通过电脉冲，然后使胚胎存活了一段时间，收集大脑，并分析它的可能的新颖，翔实的表型。以这种方式，实验者可以几乎立即测试假设没有小鼠突变体的生产所需的等待时间长。 到胚胎发育开始的DNA转染在OVO电鸡胚1。基本概念证明型的鼠标进行文化<s高达2。这很快就被随后该技术在子宫内 3,4鼠标的第一个描述。 主要的问题是转染而不杀死它们，或者母亲的大脑在子宫内的胚胎发展。学习进行必要的手术（开腹手术，注射，电穿孔），需要一个漫长的训练期。一旦手术已经掌握的胚胎存活率比是可以接受的地步，接下来的关键问题是：大脑结构进行访问？这并不奇怪，首次发表的论文，得到的结果与在子宫内的电主要集中在皮质发育5-9。这是使用这种技术刊物的大部分仍然是正确的，因为该区域是在显影最访问外科手术的小鼠大脑皮质（ 图1）。已经描述了该程序为在子宫内的电穿孔到皮质在打印10 11-14视频。可以使用的技术的修改目标端 ​​脑腹侧部，在基底神经节15。 除了端脑，间脑（传统分为丘脑和下丘脑）是前脑更难以达到的区域。少数的论文报告，针对其背鳍和最容易的部分，丘脑16-19。 下丘脑是最腹侧的前脑的一部分，因此，一个本地化的最深刻的背侧表面（皮层）（ 图1）。 在子宫内基因操作的小鼠大脑的研究人员致力于该地区仍然是一个艰巨的挑战。据我们所知，只有极少数文章报道的在宫内转染到小鼠下丘脑20,21的结果。然而，canno下丘脑功能的重要性被夸大了，因为它规定的行为，如吃喝，交配，繁殖和养育子女的22。此外，改变下丘脑发展有助于以后的生活条件，如肥胖，高血压，糖尿病，性早熟的23起源。基因能够改变下丘脑在开发过程中会提供一个非常强大的工具来了解它。 基本手术开腹孕鼠，我们这里使用的是类似的协议，用于其他协议11,13,14,24。我们将在这里简要地描述他们的完整性。我们的程序的关键，在另一方面，是不同的麻醉，注射的地方，不同的电极的正极相对于胚胎的头部插入和位置。我们优选通过气体吸入超过简单的腹腔麻醉诱导和维持麻醉，因为前者允许有些较长的麻醉需要一个艰难的手术。吸入异氟醚麻醉恢复快，因为通常是母亲表现出正常的行为已经分钟后手术。最简单的点注入的DNA溶液的玻璃微侧脑室内，但它是完全不适合丘脑电穿孔。直接在第三脑​​室注射液确实是针对深间脑结构的关键。这是可能的转染与标准的，现成的电极从E12.0或E12.5下丘脑。我们已经发现了一些特别适合来此的目的NEPA基因（日本千叶）制造的电极。 随着我们的过程中，我们得到整个下丘脑神经上皮或部分区域转取决于电极方向转。在这里，我们展示了乳头体转染技术，可以说是最深和最凹进的所有丘脑核团。此外，我们详细的组织学分析转染细胞的细胞层次的解析。 在子宫内的电转鼠标在子宫内发育中的大脑与其他方法的比较，可以发现在讨论部分。

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acepromazine</td>
			<td>Sanofi GmbH</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>HDG9623</td>
			<td>anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamin</td>
			<td>Pharma GmbH</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>44715</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rimadyl</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>non-steroidal anti-inflammatory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Braunoderm</td>
			<td>Braun</td>
			<td>3887138</td>
			<td>povidone-iodine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temgesic (buprenorphine)</td>
			<td>Essex Pharma</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>opioid analgesic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye Ointment</td>
			<td>Pan-Ophtal</td>
			<td>7136926</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaesthetic Device Komesaroff Mark-5</td>
			<td>Medical Developments Australia</td>
			<td>ACN 004 903 682</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary puller P-97</td>
			<td>Sutter Instrument Co.</td>
			<td>P-97</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compresstome</td>
			<td>Precisionary Instr.</td>
			<td>VF-300</td>
			<td>Vibratome-type device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM700</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM3050S</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator</td>
			<td>Nepa Gene Co. Ltd.</td>
			<td>CUY21EDIT</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode 1</td>
			<td>Nepa Gene Co. Ltd.</td>
			<td>CUY550-10</td>
			<td>Stainless Steel Needle Electrode, 10 mm-Tip, 0. 5 mm diam.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode 2</td>
			<td>Nepa Gene Co. Ltd.</td>
			<td>CUY700P4L</td>
			<td>Cover Round Platinum Plate 4 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiberoptic cold light source</td>
			<td>Leica</td>
			<td>KL2500 LCD</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillaries</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>GC120T-15</td>
			<td>1. 2 mm O.D. x 0. 94 mm I.D.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bead sterilizer</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>FST250</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>py872-5272</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection device</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>Pneumatic Pico Pump PV820</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture Thread Coated Vicryl</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>V4914</td>
			<td>Peritoneal Suture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture Thr. Supramid</td>
			<td>Serag Wiessner</td>
			<td>TO07171L</td>
			<td>Skin Suture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genetic manipulation of the mouse developing hypothalamus through in utero electroporation

基因改造发展哺乳动物大脑的特定区域，是一个非常强大的实验方法。但是，生成新的小鼠突变体往往是令人沮丧的缓慢。它已被证明， 在子宫内的合理的操作室后的生存期的小鼠脑开发的访问是可能的。不过，此过程的结果与已报道几乎完全发育中的大脑最肤浅和容易获得的部分， 即皮层。丘脑，更窄，更内侧的区域，已被证明更加困难的目标。转染到更深的原子核，特别是下丘脑，可能是最具挑战性的，因此很少的结果已被报道。在这里，我们展示了一个过程为目标的整个下丘脑神经上皮或它的一部分（下丘脑地区）通过电穿孔转染。我们的方法的关键是昏迷时间较长，注射在T希尔德心室，以及适当的种类和电极的定位。此外，我们将展示最凹陷的下丘脑核，乳头体定位和随后的病理分析结果。

大多数丘脑神经元之间E11.5到E15.2出生，根据在大鼠有点短的鼠标发展27,28翻译成26的出生约会分析。下丘脑神经发生的高峰期达到在E12.5 29-31。因此，在本研究转染选择的年龄（E12.5），相当大的比例的下丘脑神经元可以在任何给定的尾鳍rostro的水平标记。 分析E18.5厚vibratome的类型的段（ 图3A和3B）表明，下丘脑神经上皮的整个...

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Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

尽管下丘脑的功能和医学重要性，<em&gt;在子宫内</em&gt;遗传操纵其发展已经很少有人尝试。我们显示的详细步骤<em&gt;在子宫内</em&gt;电到老鼠的下丘脑和展示具有代表性的结果整体和局部（区域）下丘脑转。

遗传操纵鼠标的发展下丘脑通过<em&gt;在子宫内</em&gt;电穿孔

Genetic  modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very  powerful experimental approach. However, generating novel mouse ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

15.7K 次观看.  University of Heidelberg. 尽管下丘脑的功能和医学重要性，在子宫内遗传操纵其发展已经很少有人尝试。我们显示的详细步骤在子宫内电到老鼠的下丘脑和展示具有代表性的结果整体和局部（区域）下丘脑转。