עבודה זו מומנה על ידי קרן המחקר הגרמני (דויטשה Forschungsgemeinschaft).

1. הכנה של ה-DNA וזכוכית Micropipettes להזרקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> micropipettes זכוכית באיכות טובה הם חיוני כדי להפחית את שיעור הפלות גבוה ראשוני עקב אובדן של מי שפיר. ההליך למשוך micropipettes הזכוכית תועד 13,18,25 היטב. השתמשו בקוטר 1.2 מ&quot;מ נימים משך בסאטר קונבנציונלי P-97 מכשיר עם ההגדרות P = 500; חום = 300; משוך = 40; מהירות = 50; זמן = 50. להתאים את חולץ עם 3 מ&quot;מ חוטים &quot;שוקת&quot; (סאטר Instrument FT330B). את 2 חוטי מ&quot;מ הגודל הניבו עבורנו תוצאות פחות משביעות רצון. מצד השני נראה, beveling של הטיפים micropipette לא כדי לשפר את התוצאות עבורנו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים מטוהר ה-DNA, ללא רעלן פנימי פלסמיד ב PBS (כיתה תרבית תאים) המכילה 0.1% מהיר גרין לריכוז סופי של 1 עד 2 מיקרוגרם / μl. גרין המהיר יהפוך את הפתרון המוזרק לעין בחדר המוח העוברי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען 10 μl של פתרון ה-DNA לתוך micropipette הזכוכית. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את micropipette הזכוכית למערכת ההזרקה (פיקו משאבה) או פיפטה בפה. </li></ol> 2. הרדמה הכן את השולחן כירורגית עם כרית חימום ואת מכשירי הניתוח. הפעל את מקורות האור קר כדי להקל על ההדמיה של העוברים. לחטא את הכלים כירורגיים באמצעות למשל מעקר חרוז זכוכית. שלוש פרוצדורות הרדמה שונות אפשרית עבור פרוטוקול זה (ראה דיון). כאן אנו מתארים את אחד אנו רואים את הטוב ביותר, תוך שימוש בשאיפת isoflurane לזירוז הרדמה (קצב זרימה 0.5 ליטר / דקה), כמו גם התחזוקה (ליטר / דקה קצב זרימת 1). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להציג את העכבר בהריון במכל קטן שקוף (כך העכבר נשאר גלוי) מחובר למכשיר ההרדמה Komesaroff מארק 5 באורך של צינורות קצרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את מכשיר האדים עם isoflurane, ואז לפתוח את בקבוק החמצן המצורף למכשיר. לפוצץ פולסים אחת או שניים של isoflurane / חמצן (0.5 ליטר / דקה) לתוך המכל מחזיק את העכבר ולצפות להרדמה להגדיר פנימה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את העכבר, מכסה את עיניו עם משחה כדי למנוע מהם מהתייבשות ולהתאים את מסכת זרימת ההרדמה על ראשו באופן מיידי. </li></ol> 3. Laparotomy <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את עכבר בטן על כרית החימום (אחרת טמפרטורת הגוף שלו תרד מהר מאוד, ומקטין את סיכויי החלמה) ולאבטח את הגוף שלו למקומו על ידי תיקון ארבע רגליו לצדדים עם קלטת. להעריך את עומק ההרדמה על ידי בדיקה לאובדן של תגובה לגירוי רפלקס (למשל הבוהן או קמצוץ זנב עם לחץ חזק). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגלח את משטח הבטן ולחטא אותו עם iodophorpovidone יוד (Braunoderm). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות חתך אורכי (עוד 1 עד 1.5 ס&quot;מ) בעור הבטן. ואז לחתוך את הצפק. הנח גזה כותנה סביב החתך. הפוך את קרן רחם אחת לעין ולמשוך אותו החוצה בזהירות עם מלקחיים בוטים על gauz PBS והשטףדואר. שטוף את הרחם עם PBS לעתים קרובות מאוד לשמור עליו תמיד הרטיב (איורים 2 א ו -2). במהלך ההליך כולו להימנע ממשייכת mesometrium או הרחם צר, שכן בתוך הרחם בלחץ גבוה ישדר לעובר להגדיל את הסיכויים של אובדן הנוזלים וכתוצאה מכך על זריקת הפלה. </li></ol> 4. הזרקת DNA לתוך חדר המוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחזיק את הרחם בצורה כזו שהחדרים במוח יכולים להיות דמיינו. לא בהרחבה האם למקם את עובר שנמצאת בעמדה שלילית - זה מגדיל את הסיכוי של הפלה בלבד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר מסתכל על ראשו של העובר מלמעלה, בתרגום חזותי פער או הסדק בין שני חצאים קליפת המוח השמאליים וימניים. האונות הן קלה להבחין וחדרים לרוחב בתוכם (שלא להיות ממוקד) יכולים בדרך כלל להיתפס כצורות מעט כהות יותר. אם עובר נמצא להיות מכוון בצורה מושלמת להזרקת ה-DNA (Figures 2C ו 2D), זה אפשרי כדי לחדור את דופן הרחם ולהיכנס לחדר השלישי ובעונה אחת. החזק את micropipette הכוס ב 45 מעלות לקיר ולנקב אותו בסוף מקורי של הפער בין ההמיספרות בקליפת המוח הרחם, לחדור לכ 1 מ&quot;מ. בדרך זו קצה micropipette הזכוכית ייכנס לחדר השלישי של המוח (לא חדר לרוחב) (איורים 2 ג ו 2D). בעוברים פחות נוחה בכיוון זה שימושי הראשון פירס דופן הרחם (תמיד על 45 מעלות) בסביבתו של הראש העוברי, מקום קצה micropipette במיקום הנכון בין שני חצאים קליפת המוח, ורק לאחר מכן לנקב את המוח. הזרק על μl 1 של פתרון ה-DNA לתוך החדר השלישי (זריקה טובה ממלאת את החדר בנוזל ירוק). חזור על אותו התהליך עם כל העוברים של קרן רחם אחד. זה מאפשר קצת זמן לפתרון ה-DNA כדי לערבב באופן שווה עם נוזל חדרית ולהגיע entirneuroepithelium הדואר. </li></ol> 5. מיקוד היפותלמוס לElectroporation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור electroporator ובלהתאים את ההגדרות בהתאם לגיל העוברי (לE12.5 אנו משתמשים 5 פולסים מרובעים גל, 50 V, 50 אלפיות השני ON/950 אלפיות OFF). השתמש כקוטב חיובי האלקטרודה מחט הנירוסטה (CUY550-10) וכקוטב שלילי האלקטרודה עגולה ושטוחה (CUY700P4L). (חשוב שהאלקטרודות הם קטנות יותר מאשר את העובר, שכן אחרת הנוכחי פשוט זורמת סביב העובר, אבל לא דרכו.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר עבור electroporation אותם העוברים הגבי צד הוא למעלה (כלומר פנה הנסיין) (כמו רובם), ולמחוק את אלה שנטייה שלו היא לא חיובי. עכשיו זה בטוח לגעת ברחם עם אצבעות אתנול חיטוי או עם כפפות. מחזיק את הרחם עם מלקחיים, לעומת זאת, הייתי מפריע לזרימה של זרם במהלך electroporation. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פירס דופן הרחם על ידי ראשו של העובר בין א.מ.נ.השק iotic ושליה על ידי דחיפה כלפי מטה דרכו עם הקצה של האלקטרודה המחט. השתמש באצבע המורה של היד השנייה כמקשה דחף. בערך 5 מ&quot;מ של קצה האלקטרודה חייב להיות עכשיו בין השק מי השפיר ודופן הרחם, בערך ברמה של המוח התיכון (איורים 2E ו2F). זכור כי זה &quot;מיקוד אלקטרודה&quot;, כך עמדתו תהיה לקבוע איזה חלק מההיפותלמוס neuroepithelium הוא הסיכוי טוב ביותר להשיג transfected. העובר צריך להיות בעדינות רבה &quot;סחט&quot; בין האלקטרודות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם מצד השני, עמדת האלקטרודה העגולה והשטוחה מחוץ לקיר הרחם בצד השני של ראשו של העובר (2E ו 2G דמויות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במתג הדוושה כדי להחיל מתח (50 וולט, 50 אלפיות שנייה ON, 950 אלפיות השני OFF, 5 פולסים מרובעים גל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט לאט למשוך את האלקטרודה המחט מחוץ לרחם תוך מתאפק הרחם עם אצבע המורה של היד השנייה - אם בדיקה מי שפירנוזל הטיק הולך לאיבוד דרך הקיר המנוקב, בדרך כלל את העובר יעבור הפלה. לחזור על התהליך עם כל העוברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחזיר את קרן הרחם לתוך הבטן ולחזור על ההזרקה וelectroporation בצופר השריד. </li></ol> 6. גמר הניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ההזרקה וelectroporation של כל העוברים, הצב את הרחם בחזרה לתוך הבטן בזהירות רבה, ממוקם בדיוק כפי שהיו לפני ולח חלל הצפק עם מי מלח לפני שתסגרו אותו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תפר את הצפק עם מיתר כירורגית (Vicryl Polyglactin 910, 5-0, Ethicon V4914). לסגירתו של שימוש עור &quot;קטע את התפר&quot; methodwith תפר עמיד יותר (ניילון Supramid, 6-0, Serag Wiessner ל07171L). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחטא את משטח הבטן עם povidone-יוד (Braunoderm) ולהזריק ללא סטרואידים אנטי דלקתי תת עורי (לדוגמה: 100 μl של פתרון 1:10 Rimadyl ב0.9% NaCl) או, אפילו טוב יותר, כמו אופיואידים buprenorphine (Temgesic, 0.05-0.1 משקל גוף מ&quot;ג / ק&quot;ג ב0.9% NaCl) כדי להקל על כאב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את האמא מהמכונה ההרדמה ולמקם אותו בכלוב אשר מחומם על ידי כרית חימום. לפקח על העכבר ללא הרף עד שהוא התאושש לגמרי מההרדמה. בשלב מאוחר יותר, לבדוק את החיות היומיות כדי להבטיח שהם מתאוששים מההליך ללא כל סימן לזיהום או כאב. </li></ol> 7. ניתוח התוצאות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקצור את העוברים (או postnatals) לפי היום הרצוי של ניתוח. עכברים לאחר לידה (יום 1 עד 2 ישן) הם נהרגו על ידי עריפת ראש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרד כל עובר על פי ביאור electroporation הקודם. מנתחים את המוח תחת stereomicroscope ולבדוק מתחת למיקרוסקופ לאות פלואורסצנטי ירוקה (GFP מהכתב) באזור המתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המוח שנבחר יכול להיות מנותח &quot;טרי&quot;: לתקן הרקמות לזמן קצר בparaformaldehyde 4% ולהטביע ב% agarose 4 או בג&#39;לטיןlbumin, ולאחר מכן חלק על מכשיר vibratome סוג (איור 3). לניתוח מפורט יותר immunohistochemical (איור 4), cryo-להגן על המוח בפתרון saccharose 30%, להטביע בהרכבה בינונית אוקטובר (רקמות Tek) לאחר מכן לחתוך את 20 סעיפי מיקרומטר בcryostat. </li></ol>

<ol>
	<li>Itasaki, N., Bel-Vialar, S., Krumlauf, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shocking'+developments+in+chick+embryology:+electroporation+and+in+ovo+gene+expression.">Shocking' developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression.</a> Nat. Cell Biol. 1, E203-E207 (1999).</li><li>Miyasaka, N., Arimatsu, Y., Takiguchihayashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foreign+gene+expression+in+an+organotypic+culture+of+cortical+anlage+after+in+vivo+electroporation.">Foreign gene expression in an organotypic culture of cortical anlage after in vivo electroporation.</a> Neuroreport. 10, 2319-2323 (1999).</li><li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation.">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Dev. Biol. 240, 237-246 (2001).</li><li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+in+utero+gene+transfer+system+to+the+developing+mouse+brain+using+electroporation:+visualization+of+neuronal+migration+in+the+developing+cortex.">Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex.</a> Neuroscience. 103, 865-872 (2001).</li><li>Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neocortex+patterning+by+the+secreted+signaling+molecule+FGF8.">Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8.</a> Science. 294, 1071-1074 (2001).</li><li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurons+tend+to+stop+migration+and+differentiate+along+the+cortical+internal+plexiform+zones+in+the+Reelin+signal-deficient+mice.">Neurons tend to stop migration and differentiate along the cortical internal plexiform zones in the Reelin signal-deficient mice.</a> J. Neurosci. Res. 69, 723-730 (2002).</li><li>Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emx2+patterns+the+neocortex+by+regulating+FGF+positional+signaling.">Emx2 patterns the neocortex by regulating FGF positional signaling.</a> Nat. Neurosci. 6, 825-831 (2003).</li><li>Shimogori, T., Banuchi, V., Ng, H. Y., Strauss, J. B., Grove, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+signaling+centers+expressing+BMP,+WNT+and+FGF+proteins+interact+to+pattern+the+cerebral+cortex.">Embryonic signaling centers expressing BMP, WNT and FGF proteins interact to pattern the cerebral cortex.</a> Development. 131, 5639-5647 (2004).</li><li>Shimogori, T., Grove, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+8+regulates+neocortical+guidance+of+area-specific+thalamic+innervation.">Fibroblast growth factor 8 regulates neocortical guidance of area-specific thalamic innervation.</a> J. Neurosci. 25, 6550-6560 (2005).</li><li>Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+electroporation+in+the+embryonic+mouse+central+nervous+system.">In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system.</a> Nat. Protoc. 1, 1552-1558 (2006).</li><li>Dixit, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Gene+Delivery+into+Multiple+CNS+Territories+Using+In+Utero+Electroporation.">Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation.</a> J. Vis. Exp. (52), e2957 (2011).</li><li>Rice, H., Suth, S., Cavanaugh, W., Bai, J., Young-Pearse, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+Electroporation+followed+by+Primary+Neuronal+Culture+for+Studying+Gene+Function+in+Subset+of+Cortical+Neurons.">In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons.</a> J. Vis. Exp. (44), e2103 (2010).</li><li>Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Utero+Intraventricular+Injection+and+Electroporation+of+E15+Mouse+Embryos.">In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E15 Mouse Embryos.</a> J. Vis. Exp. (6), e239 (2007).</li><li>Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Utero+Intraventricular+Injection+and+Electroporation+of+E16+Rat+Embryos.">In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E16 Rat Embryos.</a> J. Vis. Exp. (6), e236 (2007).</li><li>Borrell, V., Yoshimura, Y., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+delivery+to+telencephalic+inhibitory+neurons+by+directional+in+utero+electroporation.">Targeted gene delivery to telencephalic inhibitory neurons by directional in utero electroporation.</a> J. Neurosci. Methods. 143, 151-158 (2005).</li><li>Haddad-Tovolli, R., Heide, M., Zhou, X., Blaess, S., Alvarez-Bolado, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+thalamic+differentiation:+gli-dependent+pattern+and+gli-independent+prepattern.">Mouse thalamic differentiation: gli-dependent pattern and gli-independent prepattern.</a> Front Neurosci. 6, 27 (2012).</li><li>Kataoka, A., Shimogori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fgf8+controls+regional+identity+in+the+developing+thalamus.">Fgf8 controls regional identity in the developing thalamus.</a> Development. 135, 2873-2881 (2008).</li><li>Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+in+Utero+Electroporation:+Controlled+Spatiotemporal+Gene+Transfection.">Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection.</a> J. Vis. Exp. (54), e3024 (2011).</li><li>Vue, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog+signaling+controls+thalamic+progenitor+identity+and+nuclei+specification+in+mice.">Sonic hedgehog signaling controls thalamic progenitor identity and nuclei specification in mice.</a> J. Neurosci. 29, 4484-4497 (2009).</li><li>Tanaka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+of+the+hypocretin/orexin+gene+by+NR6A1.">Transcriptional regulation of the hypocretin/orexin gene by NR6A1.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 403, 178-183 (2010).</li><li>Tsuchiya, R., Takahashi, K., Liu, F. C., Takahashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberrant+axonal+projections+from+mammillary+bodies+in+Pax6+mutant+mice:+possible+roles+of+Netrin-1+and+Slit+2+in+mammillary+projections.">Aberrant axonal projections from mammillary bodies in Pax6 mutant mice: possible roles of Netrin-1 and Slit 2 in mammillary projections.</a> J. Neurosci. Res. 87, 1620-1633 (2009).</li><li>Canteras, N. S., Watson, C., Paxinos, G., Puelles, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Mouse Nervous System. , 539-562 (2011).</li><li>Caqueret, A., Yang, C., Duplan, S., Boucher, F., Michaud, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Looking+for+trouble:+a+search+for+developmental+defects+of+the+hypothalamus.">Looking for trouble: a search for developmental defects of the hypothalamus.</a> Horm. Res. 64, 222-230 (2005).</li><li>Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+and+ex+vivo+Electroporation+for+Gene+Expression+in+Mouse+Retinal+Ganglion+Cells.">In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells.</a> J. Vis. Exp. (31), e1333 (2009).</li><li>Nijagal, A., Le, T., Wegorzewska, M., Mackenzie, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mouse+Model+of+in+Utero+Transplantation.">A Mouse Model of in Utero Transplantation.</a> J. Vis. Exp. (47), e2303 (2011).</li><li>Altman, J., Bayer, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Development+of+the+Rat+Hypothalamus.">The Development of the Rat Hypothalamus.</a> Adv. Anat. Embryol. Cell Biol. 100, 1-178 (1986).</li><li>Clancy, B., Darlington, R. B., Finlay, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translating+developmental+time+across+mammalian+species.">Translating developmental time across mammalian species.</a> Neuroscience. 105, 7-17 (2001).</li><li>Clancy, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Web-based+method+for+translating+neurodevelopment+from+laboratory+species+to+humans.">Web-based method for translating neurodevelopment from laboratory species to humans.</a> Neuroinformatics. 5, 79-94 (2007).</li><li>Ishii, Y., Bouret, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+birthdate+of+hypothalamic+leptin-activated+neurons+in+mice.">Embryonic birthdate of hypothalamic leptin-activated neurons in mice.</a> Endocrinology. 153, 3657-3667 (2012).</li><li>Karim, M. A., Sloper, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histogenesis+of+the+supraoptic+and+paraventricular+neurosecretory+cells+of+the+mouse+hypothalamus.">Histogenesis of the supraoptic and paraventricular neurosecretory cells of the mouse hypothalamus.</a> J. Anat. 130, 341-347 (1980).</li><li>Shimada, M., Nakamura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+of+neuron+origin+in+mouse+hypothalamic+nuclei.">Time of neuron origin in mouse hypothalamic nuclei.</a> Exp. Neurol. 41, 163-173 (1973).</li><li>Alvarez-Bolado, G., Paul, F. A., Blaess, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog+lineage+in+the+mouse+hypothalamus:+from+progenitor+domains+to+hypothalamic+regions.">Sonic hedgehog lineage in the mouse hypothalamus: from progenitor domains to hypothalamic regions.</a> Neural. Dev. 7, 4 (2012).</li><li>Vann, S. D., Aggleton, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mammillary+bodies:+two+memory+systems+in+one.">The mammillary bodies: two memory systems in one.</a> Nat. Rev. Neurosci. 5, 35-44 (2004).</li><li>Gratsch, T. E., De Boer, L. S., O'Shea, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+inhibition+of+BMP-4+gene+expression+in+postimplantation+mouse+embryos.">RNA inhibition of BMP-4 gene expression in postimplantation mouse embryos.</a> Genesis. 37, 12-17 (2003).</li><li>Wu, N., Yu, A. B., Zhu, H. B., Lin, X. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+silencing+of+Sry+gene+with+RNA+interference+in+developing+mouse+embryos+resulted+in+feminization+of+XY+gonad.">Effective silencing of Sry gene with RNA interference in developing mouse embryos resulted in feminization of XY gonad.</a> J. Biomed. Biotechnol. 2012, 343891 (2012).</li><li>Kikuchi, N., Nakamura, S., Ohtsuka, M., Kimura, M., Sato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Possible+mechanism+of+gene+transfer+into+early+to+mid-gestational+mouse+fetuses+by+tail+vein+injection.">Possible mechanism of gene transfer into early to mid-gestational mouse fetuses by tail vein injection.</a> Gene Ther. 9, 1529-1541 (2002).</li><li>Foust, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravascular+AAV9+preferentially+targets+neonatal+neurons+and+adult+astrocytes.">Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes.</a> Nat. Biotechnol. 27, 59-65 (2009).</li><li>Xin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+brain+targeting+mechanism+of+Angiopep-conjugated+poly(ethylene+glycol)-co-poly(epsilon-caprolactone)+nanoparticles.">The brain targeting mechanism of Angiopep-conjugated poly(ethylene glycol)-co-poly(epsilon-caprolactone) nanoparticles.</a> Biomaterials. 33, 1673-1681 (2012).</li><li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector.">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108, 193-199 (1991).</li><li>Kaufman, R. J., Davies, M. V., Wasley, L. C., Michnick, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+vectors+for+stable+expression+of+foreign+genes+in+mammalian+cells+by+use+of+the+untranslated+leader+sequence+from+EMC+virus.">Improved vectors for stable expression of foreign genes in mammalian cells by use of the untranslated leader sequence from EMC virus.</a> Nucleic Acids Res. 19, 4485-4490 (1991).</li><li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+green+fluorescent+protein.">The green fluorescent protein.</a> Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).</li><li>Londrigan, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+promoters+for+driving+efficient+transgene+expression+in+neonatal+porcine+islets.">Evaluation of promoters for driving efficient transgene expression in neonatal porcine islets.</a> Xenotransplantation. 14, 119-125 (2007).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

לגבי ההרדמה: מאז electroporation ברחם ליפותלמוס יכול להיות מבחינה טכנית מפרך ודורש פעמים הרדמה ארוכות יותר, אנחנו מעדיפים לשמור על הרדמה ולגרום באמצעות ממשל מתערובת של חמצן וisoflurane. מניסיוננו, חיות יכולות להישאר כראוי מורדמות בדרך זו לתקופות של עד שעה אחת לפחות, ההתאושש...

מניפולציה גנטית של מוח העכבר העוברי היא גישה מועדפת כדי ללמוד על רגולציה התפתחותית. הדור של קווי עכבר מוטציה עם זאת הוא איטי ויקר. שיטה רב עוצמה אחד כדי להציג את השינויים גנטיים ספציפיים בפיתוח תאי עצב במוח היונקים היא electroporation ברחם. בעיקרו של דבר, הטכניקה מורכבת transfecting דנ&quot;א לתוך neuroepithelium המוח העוברי באמצעות פולסים חשמליים, ולאחר מכן מאפשר לעובר לשרוד לתקופה מסוימת של זמן, לאסוף את המוח ולבחון אותם לרומן אפשרי, פנוטיפים אינפורמטיבי. בדרך זו, הנסיין יכול לבחון השערות באופן כמעט מיידי ללא תקופות המתנה הארוכות הנדרשות לייצור מוטציות עכבר. Transfection של ה-DNA לעוברי מתפתחים התחיל עם ב electroporation אובו בעוברי 1 חומוס. הוכחה של הקונספט החיוני לעכבר בוצע בתרבות <sעד&gt; 2. זה היה זמן קצר אחריו את התיאורים הראשונים של הטכניקה על העכבר ברחם 3,4. הבעיה העיקרית היא transfect המוח של עוברים מתפתחים ברחם בלי להרוג אותם או האם. למידה כדי לבצע את הניתוח הדרוש (laparotomy, זריקה, electroporation) דורשת תקופת הכשרה ארוכה. לאחר הניתוח כבר שולט לנקודה שבה יחס הישרדות העובר מקובל, שאלת המפתח הבאה היא: שהמבנים מוחיים נגישים? באופן לא מפתיע, את המסמכים הראשונים שפורסמו מראים תוצאות שהושגו עם electroporation ברחם מתמקדים בהתפתחות קליפת המוח 5-9. זה עדיין נכון עבור רוב הפרסומים באמצעות טכניקה זו, שכן האזור במוח העכבר מתפתח הנגיש ביותר לפרוצדורות כירורגיות הוא קליפת המוח (איור 1). ההליך לelectroporation ברחם לתוך קליפת המוח תוארבדפוס 10 ובוידאו 11-14. שינוי של הטכניקה יכול לשמש יעד חלק הגחון של telencephalon, גרעיני בסיס 15. מעבר telencephalon, diencephalon (מחולק באופן קלאסי לתלמוס וההיפותלמוס) הוא אזור של המוח הקדמי יותר הקשה להגיע. מספר קטן של דיווחי ניירות מיקוד של חלק הגבי ונגיש ביותר שלו, התלמוס 16-19. ההיפותלמוס הוא חלק הגחון ביותר של המוח הקדמי, ולכן אחד מקומי בצורה העמוקה ביותר מהמשטח הגבי (קליפת המוח) (איור 1). אזור זה עדיין מהווה אתגר קשה לחוקרים שביצעו כדי לתפעל את מוח העכבר ברחם מבחינה גנטית. למיטב ידיעתנו, רק מעט מאוד מאמרים מדווחים על התוצאות בtransfection הרחם אל ההיפותלמוס עכבר 20,21. עם זאת, חשיבותו התפקודית של canno ההיפותלמוסלא להיות מוגזם, שכן הוא מסדיר התנהגויות כמו אכילה ושתייה, חיזור, רבייה והורות 22. יתר על כן, שינויים בפיתוח ההיפותלמוס לתרום למקורן מאוחר יותר בתנאי חיים כמו השמנה, יתר לחץ דם, סוכרת ומפותחת לגיל התבגרות 23. היכולת לשנות גנטי ההיפותלמוס במהלך הפיתוח הייתי לספק כלי חזק מאוד כדי להבין את זה. הפרוטוקול כירורגית הבסיסית לlaparotomy של עכברים הרה שאנו משתמשים כאן דומה לזה המשמש בפרוטוקולים אחרים 11,13,14,24. נתאר אותן כאן בקצרה לשלמות. מפתח להליך שלנו, לעומת זאת, הם הסוג של הרדמה, את מקומה של זריקה, הסוג של אלקטרודות והחדרה ומיקום של האלקטרודה החיובית ביחס לראשו של העובר. אנחנו מעדיפים לשמור על הרדמה ולגרום באמצעות שאיפת גז על פני הרדמה intraperitoneal פשוטה, שכן לשעבר מאפשריםתקופות ממושכות יותר של הרדמה נדרשות לניתוח קשה. תוצאות isoflurane משאיפת בהתאוששות מהירה יותר מהרדמה, שכן לרוב האם מדגים התנהגות נורמלית כבר דקות לאחר הניתוח. הנקודה הקלה ביותר של זריקה של פתרון ה-DNA עם micropipette הזכוכית היא החדר לרוחב, שעם זאת היא אינו מתאים לחלוטין ליפותלמוס electroporation. הזרקה ישירות בחדר השלישי היא אכן חיונית כדי למקד מבני diencephalic עמוקים. אפשר transfect ההיפותלמוס מE12.0 או E12.5 עם אלקטרודות סטנדרטיות, ה-off-מדף. מצאנו כמה אלקטרודות שיוצרו על ידי NEPA ג&#39;ין (צ&#39;יבה, יפן) המתאימים במיוחד למטרה זו. עם ההליך שלנו אנו מקבלים transfection של neuroepithelium ההיפותלמוס השלם או החלקית transfection האזורית, בהתאם לאורינטציה של האלקטרודה. כאן אנו מדגימים את הטכניקה על ידי transfecting הגוף הפיטמתיים, ללא ספקהעמוק ביותר והשקוע ביותר של כל גרעיני ההיפותלמוס. בנוסף, אנו מציגים ניתוח היסטולוגית מפורט של תאי transfected עד לרמה התאית של רזולוציה. ניתן למצוא השוואה של electroporation ברחם עם גישות אחרות לtransfecting המוח המתפתח העכבר ברחם בסעיף הדיון.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acepromazine</td>
			<td>Sanofi GmbH</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>HDG9623</td>
			<td>anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamin</td>
			<td>Pharma GmbH</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>44715</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rimadyl</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>non-steroidal anti-inflammatory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Braunoderm</td>
			<td>Braun</td>
			<td>3887138</td>
			<td>povidone-iodine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temgesic (buprenorphine)</td>
			<td>Essex Pharma</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>opioid analgesic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye Ointment</td>
			<td>Pan-Ophtal</td>
			<td>7136926</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaesthetic Device Komesaroff Mark-5</td>
			<td>Medical Developments Australia</td>
			<td>ACN 004 903 682</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary puller P-97</td>
			<td>Sutter Instrument Co.</td>
			<td>P-97</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compresstome</td>
			<td>Precisionary Instr.</td>
			<td>VF-300</td>
			<td>Vibratome-type device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM700</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM3050S</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator</td>
			<td>Nepa Gene Co. Ltd.</td>
			<td>CUY21EDIT</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode 1</td>
			<td>Nepa Gene Co. Ltd.</td>
			<td>CUY550-10</td>
			<td>Stainless Steel Needle Electrode, 10 mm-Tip, 0. 5 mm diam.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode 2</td>
			<td>Nepa Gene Co. Ltd.</td>
			<td>CUY700P4L</td>
			<td>Cover Round Platinum Plate 4 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiberoptic cold light source</td>
			<td>Leica</td>
			<td>KL2500 LCD</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillaries</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>GC120T-15</td>
			<td>1. 2 mm O.D. x 0. 94 mm I.D.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bead sterilizer</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>FST250</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>py872-5272</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection device</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>Pneumatic Pico Pump PV820</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture Thread Coated Vicryl</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>V4914</td>
			<td>Peritoneal Suture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture Thr. Supramid</td>
			<td>Serag Wiessner</td>
			<td>TO07171L</td>
			<td>Skin Suture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genetic manipulation of the mouse developing hypothalamus through in utero electroporation

שינוי גנטי של אזורים מסוימים במוח היונקים הפיתוח הוא גישה ניסויית חזקה מאוד. עם זאת, יצירת מוטציות עכבר רומן היא לעתים קרובות מתסכל איטית. הוכח כי הגישה למוח העכבר מתפתח ברחם בהישרדות לאחר ניתוח סביר אפשרית. ובכל זאת, עם תוצאות הליך זה כבר דיווח כמעט אך ורק לחלק השטחי ביותר ונגיש של המוח המתפתח, כלומר את קליפת המוח. התלמוס, אזור צר יותר ויותר המדיאלי, הוכיח קשה יותר ליעד. Transfection לגרעינים עמוקים יותר, במיוחד אלה של ההיפותלמוס, הוא אולי כבר דיווח על התוצאות המאתגרות ביותר, ולכן מעטים מאוד. כאן אנו מדגימים הליך למקד neuroepithelium ההיפותלמוס כולו או חלק ממנו (אזורי ההיפותלמוס) לtransfection באמצעות electroporation. המפתחות לגישה שלנו הם יותר הרדמת פעמים, הזרקה בtתוכי חדר, ואדיב ומיקום של האלקטרודות מתאימים. בנוסף, אנו מציגים תוצאות של מיקוד והניתוח היסטולוגית הבא של גרעין ההיפותלמוס השקוע ביותר, הגוף הפיטמתיים.

רוב הנוירונים היפותלמוס נולדים בין E11.5 לE15.2, על פי ניתוח היכרויות לידה בעכברוש 26 מתורגמים לפיתוח עכבר 27,28 הקצר יותר במקצת. השיא של neurogenesis ההיפותלמוס הוא הגיע בE12.5 29-31. בהתאם לכך, בגיל transfection נבחר למחקר הנוכחי (E12.5), יכול להיות מתויג בחלק גדול של תאי עצב ה...

Watch this Scientific Journal Video about Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation at JoVE.com

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

למרות החשיבות הפונקציונלית ורפואית של ההיפותלמוס,<em&gt; ברחם</em&gt; מניפולציה גנטית של הפיתוח שלה כבר ניסה רק לעתים נדירות. אנחנו מראים נוהל מפורט ל<em&gt; ברחם</em&gt; Electroporation ליפותלמוס העכבר ותוצאות נציג מופע של transfection (אזורי) ההיפותלמוס המוחלט והחלקית.

מניפולציה גנטית של העכבר באמצעות פיתוח היפותלמוס<em&gt; ברחם</em&gt; Electroporation

Genetic  modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very  powerful experimental approach. However, generating novel mouse ...

genetic-manipulation-mouse-developing-hypothalamus-through-utero

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

15.7K Views.  University of Heidelberg. למרות החשיבות הפונקציונלית ורפואית של ההיפותלמוס, ברחם מניפולציה גנטית של הפיתוח שלה כבר ניסה רק לעתים נדירות. אנחנו מראים נוהל מפורט ל ברחם Electroporation ליפותלמוס העכבר ותוצאות נציג מופע של transfection (אזורי) ההיפותלמוס המוחלט והחלקית.

Video: Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

ב electroporation vivo של הרשתית עכבר פיתוח

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

עכבר בתוך הרחם Electroporation: ג&#39;ין מבוקרת transfection Spatiotemporal

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

The mammalian inner ear has 6 distinct sensory epithelia: 3 cristae in the ampullae of the semicircular canals; maculae in the utricle and saccule; and the organ of Corti in the coiled cochlea. The cristae and maculae contain vestibular hair cells that transduce mechanical stimuli to subserve the special sense of balance, while auditory hair cells in the organ of Corti are the primary transducers for hearing 1. Cell fate specification in these sensory epithelia and morphogenesis of the semicircular canals and cochlea take place during the second week of gestation in the mouse and are largely completed before birth 2,3. Developmental studies of the mouse inner ear are routinely conducted by harvesting transgenic embryos at different embryonic or postnatal stages to gain insight into the molecular basis of cellular and/or morphological phenotypes 4,5. We hypothesize that gene transfer to the developing mouse inner ear in utero in the context of gain- and loss-of-function studies represents a complimentary approach to traditional mouse transgenesis for the interrogation of the genetic mechanisms underlying mammalian inner ear development6.
The experimental paradigm to conduct gene misexpression studies in the developing mouse inner ear demonstrated here resolves into three general steps: 1) ventral laparotomy; 2) transuterine microinjection; and 3) in vivo electroporation. Ventral laparotomy is a mouse survival surgical technique that permits externalization of the uterus to gain experimental access to the implanted embryos7. Transuterine microinjection is the use of beveled, glass capillary micropipettes to introduce expression plasmid into the lumen of the otic vesicle or otocyst. In vivo electroporation is the application of square wave, direct current pulses to drive expression plasmid into progenitor cells8-10. 
We previously described this electroporation-based gene transfer technique and included detailed notes on each step of the protocol11. Mouse experimental embryological techniques can be difficult to learn from prose and still images alone. In the present work, we demonstrate the 3 steps in the gene transfer procedure. Most critically, we deploy digital video microscopy to show precisely how to: 1) identify embryo orientation in utero; 2) reorient embryos for targeting injections to the otocyst; 3) microinject DNA mixed with tracer dye solution into the otocyst at embryonic days 11.5 and 12.5; 4) electroporate the injected otocyst; and 5) label electroporated embryos for postnatal selection at birth. We provide representative examples of successfully transfected inner ears; a pictorial guide to the most common causes of otocyst mistargeting; discuss how to avoid common methodological errors; and present guidelines for writing an in utero gene transfer animal care protocol.

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

The mouse inner ear is a placode-derived sensory organ whose developmental program is elaborated during gestation. We define an in utero gene transfer technique consisting of three steps: mouse ventral laparotomy, transuterine microinjection, and in vivo electroporation. We use digital video microscopy to demonstrate the critical experimental embryological techniques.

ין העברת לאוזן הפנימית על ידי פיתוח מאוס<em&gt; In vivo</em&gt; Electroporation

The mammalian inner ear has 6 distinct sensory epithelia: 3 cristae in the ampullae of the semicircular canals; maculae in the utricle and saccule; and ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

להדמיה מניפולציה גנטית של דנדריטים עם קוצים בקליפת עכבר היפוקמפוס מוחין באמצעות<em&gt; ברחם</em&gt; Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

מניפולציה גנטית של Cerebellar גרגיר נוירונים<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; בVivo</em&gt; ללמוד עצבי מורפולוגיה וגירה

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse

In utero electroporation is a widely used technique for fast and efficient spatiotemporal manipulation of various genes in the rodent central nervous system. Overexpression of desired genes is just as possible as shRNA mediated loss-of-function studies. Therefore it offers a wide range of applications. The feasibility to target particular cells in a distinct area further increases the range of potential applications of this very useful method. For efficiently targeting specific regions knowledge about the subtleties, such as the embryonic stage, the voltage to apply and most importantly the position of the electrodes, is indispensable.
Here, we provide a detailed protocol that allows for specific and efficient in utero electroporation of several regions of the C57BL/6 mouse central nervous system. In particular it is shown how to transfect regions the develop into the retrosplenial cortex, the motor cortex, the somatosensory cortex, the piriform cortex, the cornu ammonis 1-3, the dentate gyrus, the striatum, the lateral septal nucleus, the thalamus and the hypothalamus. For this information about the appropriate embryonic stage, the appropriate voltage for the corresponding embryonic stage is provided. Most importantly an angle-map, which indicates the appropriate position of the positive pole, is depicted. This standardized protocol helps to facilitate efficient in utero electroporation, which might also lead to a reduced number of animals.

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse

This protocol describes in detail how to specifically transfect different regions in the C57BL/6 central nervous system via in utero electroporation. Included in this protocol are detailed instructions for transfections of regions that develop into the cortex, hippocampus, thalamus, hypothalamus, lateral septal nucleus and striatum.

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, רוחב מחיצת גרעין, וסטריאטום ספציפי<em&gt; ברחם</em&gt; Electroporation בC57BL / 6 העכבר

In utero electroporation is a widely used technique for fast and efficient spatiotemporal manipulation of various genes in the rodent central nervous ...

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, their distinct dendritic morphologies, their specific patterns of axonal connectivity, and their selective firing responses. The molecular and cellular mechanisms responsible for these aspects of differentiation during development are still poorly understood.
Here, we describe combined protocols for labeling and characterizing the structural connectivity and excitability of cortical neurons. Modification of the in utero electroporation (IUE) protocol allows the labeling of a sparse population of neurons. This, in turn, enables the identification and tracking of the dendrites and axons of individual neurons, the precise characterization of the laminar location of axonal projections, and morphometric analysis. IUE can also be used to investigate changes in the excitability of wild-type (WT) or genetically modified neurons by combining it with whole-cell recording from acute slices of electroporated brains. These two techniques contribute to a better understanding of the coupling of structural and functional connectivity and of the molecular mechanisms controlling neuronal diversity during development. These developmental processes have important implications on axonal wiring, the functional diversity of neurons, and the biology of cognitive disorders.

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

This manuscript provides protocols that use in utero electroporation (IUE) to describe the structural connectivity of neurons at the single-cell level and the excitability of fluorescently labeled neurons. Histology is used to characterize dendritic and axonal projections. Whole-cell recording in acute slices is used to investigate excitability.

ברחם Electroporation גישות לחקר רגישות של העצבית subpopulations וקישוריות תא יחיד

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It has helped to describe the different steps of radial migration and characterize the molecular mechanisms controlling this process. To directly and dynamically analyze migrating neurons they have to be traced over time. This protocol describes a workflow that combines in utero electroporation with organotypic slice culture and time-lapse confocal imaging, which allows for a direct examination and dynamic analysis of radially migrating cortical neurons. Furthermore, detailed characterization of migrating neurons, such as migration speed, speed profiles, as well as radial orientation changes, is possible. The method can easily be adapted to perform functional analyses of genes of interest in radially migrating cortical neurons by loss and gain of function as well as rescue experiments. Time-lapse imaging of migrating neurons is a state-of-the-art technique that once established is a potent tool to study the development of the cerebral cortex in mouse models of neuronal migration disorders.

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

This protocol provides instructions for direct observation of radially migrating cortical neurons. In utero electroporation, organotypic slice culture, and time-lapse confocal imaging are combined to directly and dynamically study the effects of overexpression or downregulation of genes of interest in migrating neurons and to analyze their differentiation during development.

זמן לשגות Confocal הדמיה של נוירונים נודדים תרבות פרוסה Organotypic של המוח עכבר עובריים באמצעות<em&gt; באוטרו</em&gt; Electroporation

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It ...

Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation

Cell-autonomous neuronal functions of genes can be revealed by causing loss or gain of function of a gene in a small and sparse population of neurons. To do so requires generating a mosaic in which neurons with loss or gain of function of a gene are surrounded by genetically unperturbed tissue. Here, we combine the Cre-lox recombination system with in utero electroporation in order to generate mosaic brain tissue that can be used to study the cell-autonomous function of genes in neurons. DNA constructs (available through repositories), coding for a fluorescent label and Cre recombinase, are introduced into developing cortical neurons containing genes flanked with loxP sites in the brains of mouse embryos using in utero electroporation. Additionally, we describe various adaptations to the in utero electroporation method that increase survivability and reproducibility. This method also involves establishing a titer for Cre-mediated recombination in a sparse or dense population of neurons. Histological preparations of labeled brain tissue do not require (but can be adapted to) immunohistochemistry. The constructs used guarantee that fluorescently labeled neurons carry the gene for Cre recombinase. Histological preparations allow morphological analysis of neurons through confocal imaging of dendritic and axonal arbors and dendritic spines. Because loss or gain of function is achieved in sparse mosaic tissue, this method permits the study of cell-autonomous necessity and sufficiency of gene products in vivo.

Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation

Cell-autonomous functions of genes in the brain can be studied by inducing loss or gain of function in sparse populations of cells. Here, we describe in utero electroporation to deliver Cre recombinase into sparse populations of developing cortical neurons with floxed genes to cause loss of function in vivo.

גרימת Cre-לקס רקומבינציה ב העכבר קליפת המוח דרך בתוך הרחם אלקטרופורציה

Cell-autonomous neuronal functions of genes can be revealed by causing loss or gain of function of a gene in a small and sparse population of neurons. To ...

Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Neonatal Mouse Brains

Many genes are expressed in embryonic brains, and some of them are continuously expressed in the brain after birth. For such persistently expressed genes, they may function to regulate the developmental process and/or physiological function in neonatal brains. To investigate neurobiological functions of specific genes in the brain, it is essential to inactivate genes in the brain. Here, we describe a simple stereotaxic method to inactivate gene expression in the striatum of transgenic mice at neonatal time windows. AAV-eGFP-Cre viruses were microinjected into the striatum of Ai14 reporter gene mice at postnatal day (P) 2 by stereotaxic brain surgery. The tdTomato reporter gene expression was detected in P14 striatum, suggesting a successful Cre-loxP mediated DNA recombination in AAV-transduced striatal cells. We further validated this technique by microinjecting AAV-eGFP-Cre viruses into P2Foxp2fl/fl mice. Double labeling of GFP and Foxp2 showed that GFP-positive cells lacked Foxp2 immunoreactivity in P9 striatum, suggesting the loss of Foxp2 protein in AAV-eGFP-Cre transduced striatal cells. Taken together, these results demonstrate an effective genetic deletion by stereotaxically microinjected AAV-eGFP-Cre viruses in specific neuronal populations in the neonatal brains of floxed transgenic mice. In conclusion, our stereotaxic technique provides an easy and simple platform for genetic manipulation in neonatal mouse brains. The technique can not only be used to delete genes in specific regions of neonatal brains, but it also can be used to inject pharmacological drugs, neuronal tracers, genetically modified optogenetics and chemogenetics proteins, neuronal activity indicators and other reagents into the striatum of neonatal mouse brains.

We describe a protocol of stereotaxic surgery with a homemade head-fixed device for microinjecting reagents into the striatum of neonatal mouse brains. This technique allows genetic manipulation in neuronal cells of specific regions of neonatal mouse brains.

ניתוח stereotaxic מניפולציה גנטית בתאים Striatal של מוח העכבר Neonatal

Many genes are expressed in embryonic brains, and some of them are continuously expressed in the brain after birth. For such persistently expressed genes, ...