与Isja德Feijter和马特·贝克有益的讨论表示诚挚的谢意。

1。该传感器的合成<ol><li>在以下部分中，我们提供了一个程序的pH值指标，PAMAM树枝状聚合物的缀合。相同的协议，可以以最小的修改被应用到另一种胺-轴承树枝状聚合物。5,17,13,14市售的树枝状聚合物和染料可以不经进一步纯化使用。 </li><li>溶解树枝状聚合物在无水DMSO（50μM终浓度）。在无水DMSO中制备10mM的储备溶液的荧光素-NHS和四甲基罗丹明-NHS（TMR）的。 </li><li>添加到树枝状聚合物溶液的荧光素和TMR的所需量。在混合物中的摩尔比将反映染料上的树枝状聚合物装入的量。通常为1毫升的离心管G4 PAMAM树枝状聚合物溶液与8当量的荧光素（40微升）和8当量的TMR（40微升）。搅拌该溶液在室温下搅拌12小时。 </li><li>稀释1:10去离子水，并加载该反应混合物透析袋（截留分子量= 10 kDa的）。透析24小时，用去离子水经常更换水在储。 </li><li>将该溶液转移至小瓶中并冷冻干燥24小时。紫色粉末应获得。重量所得到的固体，并在10μM的最终浓度溶解在milliQ水中。分装，在-20℃下的溶液，并存储</li></ol> 2， 体外 pH测量<ol><li>用于体外校准制备树枝状聚合物的溶液中500nm处的PBS（2 mM磷酸盐）的石英比色杯中。建议使用非常稀的PBS缓冲液（2毫摩尔），以避免pH值的滴定过程中的突然变化。 </li><li>测量荧光素（EXC 488 nm）和TMR（EXC 550 nm）的发射光谱和优化荧光计的光学设置，以达到良好的信号噪声比。 </li><li>通过添加少量的氢氧化钠0.1N的盐酸和0.1 N。进行pH滴定后每增加摇试管进行搅拌，等待1分钟进行平衡，并通过pH微电极的方法测量pH值。荧光素和TMR的发射光谱应记录没有光学设置的任何改变每一步。 </li><li>绘制荧光强度与pH值的滴定。若丹明信号应该由pH值（&lt;10％）受到影响。荧光素信号应该是一个S形曲线，并应配有与PK = 6.4单绑定模型。 </li></ol> 3。细胞培养与电穿孔<ol><li>培养在补充有10％胎牛血清和100 U / ml青霉素和100毫克/毫升链霉素（Invitrogen）的Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）的HeLa细胞。保持细胞培养物在37℃下在湿润的5％CO 2的气氛。 </li><li>对于树枝状电，当细胞汇合，取出介质，并使用DPBS（Dulbecco氏磷酸盐缓冲液）洗涤细胞。除去DPBS，并添加胰蛋白酶-EDTA。中和胰通过添加含血清培养基但不犯罪的抗生素。离心机在900-1,200 rpm下在室温下2分钟。取出介质，并用DPBS冲洗颗​​粒。 </li><li>计数细胞，并采取4×10 6个细胞。离心机在1,200-1,500 rpm下在室温下2分钟。 </li><li>重悬细胞沉淀中加入200μl微穿孔缓冲液（由microporator厂家提供）和细胞转移到1.5 ml离心管。 </li><li>加树枝状聚合物水溶液为悬浮细胞。每个样品所需的树枝状聚合物的量取决于PAMAM型（通常为250纳米的阳离子和2微米中性树枝状）。 </li><li>加电穿孔缓冲液（由microporator厂家提供）在微穿孔管。吸取与100μl的体积尺寸的电穿孔尖端的细胞和树枝状聚合物的混合物。将microporator吸管插入吸管站。设置为微穿孔脉象：脉冲电压为1,005 V;妇女参与发展的脉搏TH = 35毫秒，脉冲数= 2。 </li><li>后的脉冲传递细胞到1.5ml微量离心管中，离心细胞5分钟，在1,200 rpm下以除去培养基中的过量的树枝状聚合物。板10微升电穿孔细胞到35 mm玻璃底菜（Willco公司 - 菜GWSt-3522）用新鲜培养基W / O型抗生素。 </li></ol> 4。生活在HeLa细胞的pH传感<ol><li>以电穿孔后共聚焦显微镜12小时图象的细胞。 </li><li>可用于荧光素和罗丹明标准滤波器组。若可调谐滤波器可安排从500绿色通道 - 550nm和红色通道从580纳米到650纳米。激发波长为488nm处是最佳的荧光素罗丹明时可成像要么与543nm或561激光线。 </li><li>聚焦在试样上，并调整激光功率和检测器增益最大化的信号 - 噪声比。如果电穿孔是成功的细胞应该是在两个通道的明亮的荧光。该本地化取决于所使用的树枝状聚合物的大小和电荷。往往是一些溶酶体定位（核周小囊泡）是由于内吞作用或条块存在。如果溶酶体定位是主要的， 即大部分的荧光是局部内囊泡，差信号在胞液中被观测到，这意味着毒性和测量应该被丢弃。顺序地获取两个通道，如果需要获取多个图像和平均化图像，以提高图像质量。 </li><li>使用缓冲液校准夹具细胞的pH与离子载体在不同的pH和如上所述获得每个pH值至少为20的细胞。对于该过程的详细描述和缓冲器的组合物，请参阅Bizzarri的同事和16中，我们建议至少测量5个点在pH = 5.5至pH = 7.5。 pH值低于6是有毒的细胞，但容忍的时间较短，我们建议获得尽可能快的图像。如果细胞证明细胞凋亡的迹象，丢弃电池，然后重新启动。 </li><li>使用ImageJ的或用于数据分析的类似软件。导入的绿色和红色通道的图像，减去背景和由像素比成像与工具“图像计算器”创建一个像素。 </li><li>绘制感兴趣区（ROI）选择所需的单元格的区域，并测量细胞内的绿色到红色的比例。分析所有获取的图像，然后绘制比与pH值。在从5.5到7.5的范围内的趋势应该是线性的。所得到的点的线性拟合会给将用于绿色到红色比转换至pH的校准曲线。 </li><li>作为进一步的控制收购一些未经处理的细胞（无离子载体），并尝试计算pH值与所获得的校准曲线。应获得7.2和7.4之间的值。 </li></ol> 5， 体内样品制备<ol><li>实验产后d所对C57BL/6J（男性和女性）进行AY 28和70。麻醉的小鼠腹膜内注射乌拉坦（ 即乙基氨基甲酸酯）（20％w / v的在生理盐水中，20毫克/公斤的聚氨酯）。实验与聚氨酯的后跟一个心内注射相同的麻醉剂过量后处死动物。 </li><li>进行注射地塞米松磷酸钠（2毫克/千克体重）肌肉内，以减少外科手术过程中的皮质应激反应和脑水肿。 </li><li>剃除动物的头部和应用2.5％利多卡因凝胶在头皮上。 </li><li>用剪刀剪下的皮肤覆盖南北半球的颅骨皮瓣</li><li>用生理盐水冲洗骨外露，轻轻地用镊子取出骨膜。这将提供胶水和牙科用粘固剂附着有更好的基础。 </li><li>套用一个特制的钢头后与中央成像室，并与氰基丙烯酸酯在一个平面上胶水约与头骨i的皮层区域平行nterest并修复到位，白色的牙齿水泥（Paladur）。 </li><li>修正了鼠标的头部，以执行2-3毫米直径钻孔在该地区的利益开颅手术。 </li><li>尝试手术，硬脑膜撕裂，或出血期间尽量减少皮质加热。 </li><li>保持灌流用无菌ACSF（126 mM氯化钠，3 mM的氯化钾，1.2mM的KH 2 PO 4，1.3 mM的MgSO 4干燥，26毫米的NaHCO 3，2.4毫米氯化钙2皮层，15mM的葡萄糖，1.2毫摩尔HEPES中蒸馏H 2 O的，pH值= 7.4）。 </li></ol> 6。在小鼠脑成像pH值<ol><li>在实验过程中帮助动物的呼吸提供氧气的富氧空气。氧被浓缩至高达80％。 O 2分压和流量经常调整，以获得正确的呼吸辅助。保持体温恒定在37℃与反馈控制的加热毯。 </li><li>通过以下的两个照片的目标的钢后的修复动物Ñ​​成像设置。 </li><li>为了将传感器在大脑皮质注入装入含有氯化银电极（尖端直径为4毫米），树枝状聚合物溶液（1μM）的玻璃移液管。电极将允许录制外场电位。 </li><li>用显微注射法设置插入吸移管在皮层，大约150微米的深度。注射1-2分钟在0.5 psi的压力。 </li><li>优化的光学装置的成像。激光功率应调整，以减少光漂白和光损伤。采用通常的激光功率大约为20毫瓦，而光电倍增管的增益保持恒定在667因为V先前校正表明，该电压提供了最好的S / N比。 </li><li>对于成像激励传感器在820 nm和通过标准FITC和TRITC过滤器同时检测荧光素和罗丹明荧光。 </li><li>时间分辨测量采集时间的推移扳成2赫兹。 </li><li>背景校正获得一个黑暗的框架落色ř快门关闭来衡量，通常由电子添加的光电倍增管和底座所产生的平均热噪声。 </li><li>数据分析报告遵循在第4相同的步骤。 </li></ol>

<ol>
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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seizure+termination+by+acidosis+depends+on+ASIC1a.">Seizure termination by acidosis depends on ASIC1a.</a> Nature neuroscience. 11 (7), 816-822 (2008).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Probes Handbook, A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies. , (2010).</li></ol>

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对于成功的pH成像与树枝状聚合物基传感器的关键步骤是：在正确的树突状支架ⅰ）选择和缀合到它指示的数目和传感器递送协议ⅱ）在细胞内或体内的最优化。 该合成过程是相当容易的，并且可以几乎应用于每个胺息的超支化聚合物。该传感器可以由一个单步市售的树枝状聚合物与NHS-活化的染料来获得。我们认为，这种模块化和简单的过程将有利于为各种生?...

利用荧光分子标记特定的生物相关分子已经完全改变了我们研究生物系统的方式。广角并允许生物过程的实时高分辨率的可视化和时下激光共聚焦显微镜是最流行 ​​的技术，研究在体外生物事件，在细胞和体内 。1一个相应的改进是由荧光指标的发展代表即染料的荧光是依赖于特定的分子实体的浓度。尤其是pH值和钙指标对细胞生理学研究产生了巨大影响，由于H +和Ca 2 +的离子在生物的巨大意义。2,3 然而，大多数目前的传感染料的几个固有的局限性与他们的小分子的行为，如：i）于亚细胞targeti困难纳克;在水中，因而差的生物相容性ⅱ）溶解性差;以及iii）细胞渗漏，因而缺乏长时间推移成像能力4此外，许多探针的信号不能被校正，以染料浓度的依赖性（非比例成像），因此，在细胞中或在体内的绝对测量是不可能的。 最近，我们描述一个简单而有效的方法来克服这些限制，基于传感染料的树枝状聚合物骨架共轭。5树枝状化合物是单分散性的超支化聚合物具有非常吸引人的特性对于生物学应用。6特别一些树突状结构已被开发并用于药物7和基因传递。8只最近几个小组开始研究这些分子作为支架材料用于传感设备的潜力。9,10,11 我们以前描述了基于NHS活化酯对不同聚酰胺-胺的官能化的容易合成路线（PAMAM）支架12的结合物可以在单一步骤中通过透析的方法，因为只有纯化而获得。有趣的是这种方法可以很容易地应用到各种各样的树突或聚合物骨架。13,14 实现成像比例分别为树枝状双标有两套染料：ⅰ）一个pH指示剂（ 即荧光素）和ii）的pH非依赖性的荧光部分（ 例如若丹明）。这使我们能够进行精确的pH值成像的荧光素和罗丹明之间的比率为仅依赖于pH值，没有更多的探针的浓度。另一个有趣的方法这个问题是通过使用生命周期为基础的探针。15表示为终身不依赖于探针浓度这些测量不需要比例修正。然而，LIFETIME测量需要一个更复杂的仪器的设置和它们的时间分辨率是次优的用于快速的生理过程，从而限制了它们的应用潜力。 为了进行细胞内成像，探针需要跨质膜被传递到胞质溶胶中。作为树枝状聚合物不会由于它们的尺寸和亲水性膜渗透性，细胞内递送可通过电穿孔来实现。通过这种技术，广泛应用于生物学转染的方式，标记大分子可以有效地传递到细胞内进行高品质的影像。此外，与电穿​​孔可避免与树枝状聚合物的内吞作用的复杂的大分子被直接递送到细胞质中。有趣的是电穿孔后不同树枝状显示单元，即使在没有任何具体的靶向序列内不同的本地化。5本PASSIVË目标，只是由于树枝状聚合物的物理化学性质，可以被利用来实现细胞器特定的pH成像。 比例成像可以使用共焦显微镜来进行。荧光素和若丹明，共价偶联到树枝状骨架，分别成像，并创建一个像素由像素比例的地图。据报道几个程序由离子载体的手段来控制细胞内pH值在活细胞。离子载体是小的疏水性分子能够穿过细胞膜的运输离子;离子载体为H +离子，如尼日利亚菌素，都是有效的，可用于校准树枝状聚合物为基础的传感器16，这些测量结果表明，以pH值线性响应类似于所观察到的。 体外 。在校准细胞内pH值的基础上可以正确地测定。这些测量结果表明，树枝状聚合物为基础的传感器可以在研究H +的homeost一个有价值的工具ASIS在活细胞和病理过程，涉及pH值调节故障。 我们最近表明，树枝状聚合物为基础的pH传感器也能在体内被应用，在麻醉小鼠的大脑进行成像pH值17由于生物组织体内感应一个高品质在技术上具有挑战性的复杂环境。这里，我们表明所述的实验步骤在体内 pH值成像的寻址到在大脑中进行准确的pH值成像的关键问题加重的详细描述。双光子显微镜已受聘主要有两个原因：一）使用红外光能够克服缺乏标准的共聚焦显微镜组织渗透的;二）荧光素和罗丹明的广泛双光子吸收让他们同时激发回避并发症相关的使用的两个波长进行激发。在小鼠大脑的pH测量是顺利进行;传感器容易缺氧诱导响应pH值在脑细胞外空间的变化。这些测量结果表明，树枝状聚合物为基础的指标，可以成功地用来突出pH值的生理和病理变化在体内在动物模型。

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
		 <td>Company</td>
		 <td>Catalogue number</td>
		 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
	 <tr>
	 <td>PAMAM G4</td>
		 <td>Sigma-Aldrich</td>
		 <td>412449</td>
		 <td></td>
	 </tr>
	 <tr>
	 <td>Carboxyfluorescein NHS ester</td>
		 <td>Life technologies</td>
		 <td>C-1311</td>
		 <td></td>
	 </tr>
	 <tr>
	 <td>TMR NHS ester</td>
		 <td>Life technologies</td>
		 <td>C-1171</td>
		 <td></td>
	 </tr>
	 <tr>
	 <td>DMSO</td>
		 <td>Sigma-Aldrich</td>
		 <td>D8418</td>
		 <td></td>
	 </tr>
	 <tr>
	 <td>Dyalsis bags</td>
		 <td>Spectrum Labs</td>
		 <td>132117</td>
		 <td></td>
	 </tr>
	 <tr>
	 <td>WillCo Dishes</td>
		 <td>WillCo Wells</td>
		 <td>GWSt-3512</td>
		 <td></td>
	 </tr>
	 <tr>
	 <td>Urethane</td>
		 <td>Sigma-Aldrich</td>
		 <td>U2500</td>
		 <td></td>
	 </tr>
 </tbody>
</table>

synthesis, cellular delivery and in vivo application of dendrimer-based ph sensors

荧光指标的发展为代表的生命科学的一场革命。基因编码的，并与感测能力的合成的荧光团可生物相关物质的高空间和时间分辨率的可视化。合成染料是特别感兴趣得益于其高可调性和广泛的可测量的分析物。然而，这些分子蒙受小分子行为的若干限制（溶解性差，在定位困难，常无比例成像允许的）。在此工作中，我们介绍的树枝状聚合物基传感器的开发和在体外呈现程序用于pH测量，在活细胞和活体 。我们选择树枝状为我们的传感器理想的平台，他们的许多理想性能（单分散性，可调性，多价），使他们广泛使用的脚手架几个生物医学设备。荧光pH值的共轭指标，树枝状聚合物骨架导致其感测性能的增强。特别是树枝状展览减少细胞渗出，改善细胞内定位，并允许比例测量。这些新颖的传感器被成功地用于测量pH值在活的HeLa细胞和体内在小鼠脑。

图1示出的传感染料以不同的树枝状骨架的缀合的示意图。所得到的指标，可以从市售品1容易合成的步骤来获得。胺息树枝状化合物与NHS-活化的染料在DMSO中，并通过渗析提纯。这是一般的程序已经被成功地用于多种树枝状标签：我）PAMAM树形分子的产生2，4和6; 12聚乙二醇化树形分子17和PEG-树突状杂种18。作为不同的树枝状聚合物显示出与细胞和组织（本地化?...

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Synthesis, Cellular Delivery and In vivo Application of Dendrimer-based pH Sensors

荧光传感器是在生命科学的强大工具。这里我们描述的方法来合成，并使用树枝状聚合物为基础的荧光传感器来测量pH值在活细胞和活体 。树突状支架增强的共轭荧光染料从而提高传感特性的属性。

合成，细胞和交货<em&gt;在体内</em&gt;的树状为基础的pH值传感器应用

The development of  fluorescent indicators represented a revolution for life sciences. Genetically  encoded and synthetic fluorophores with sensing ...

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Acid-base and Solubility Equilibria

SCIENTISTS IN ACTION

11.6K 次观看.  Eindhoven University of Technology & NEST, Scuola Normale Superiore and Istituto Nanoscienze-CNR. 荧光传感器是在生命科学的强大工具。这里我们描述的方法来合成，并使用树枝状聚合物为基础的荧光传感器来测量pH值在活细胞和活体 。树突状支架增强的共轭荧光染料从而提高传感特性的属性。 