我们感谢鼠资源研究中心，美国密苏里大学，哥伦比亚大学，密苏里州，提供GFP鼠; Neuralstem公司提供人类神经干细胞。这项工作是由退伍军人管理局，美国国立卫生研究院（NS09881），加拿大脊髓研究组织，该克雷格H.尼尔森基金会，伯纳德和安妮·斯皮策慈善基金的支持。

所有动物的协议是由弗吉尼亚州圣地亚哥机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。实验动物护理和安全指引，美国国立卫生研究院严格遵循。动物可以免费获得食物和水在整个研究和充分治疗减少疼痛和不适。 1，含生长因子鸡尾酒纤维蛋白组分的制备<ol><li>溶解25毫克大鼠纤维蛋白原在0.5ml PBS中，以得到50毫克/毫升2×原液（见材料表）。纤维蛋白原是难于溶解，并应置于37℃培养箱或水浴和动摇每隔5-10分钟1-2小时。 </li><li>溶解100 UN大鼠凝血酶在2ml的10mM无菌的CaCl 2，得到50 U / ml的2×储液。 </li><li>溶解在PBS中的生长因子以下列浓度，得到100微升储备溶液：1毫克/毫升：BDNF; NT-3（高浓度股票鞘内输注体内 <sup&gt; 19）; 200微克/毫升：GDNF;胰岛素样生长因子; bFGF的;表皮生长因子;血小板衍生生长因子;的aFGF;肝细胞生长因子（除用于细胞培养大约1000倍以上）。 </li><li>溶解25毫克MDL28170（蛋白酶抑制剂）的130毫升DMSO中，得到50mM的DMSO储备溶液，然后稀释50倍的PBS中，得到1mM储备溶液。 </li><li>混合100μl的各生长因子组分和100μlMDL28170（1mM储备溶液），以产生1,000微升生长因子鸡尾酒溶液（ 图1）。 </li><li>混合500μl的血纤维蛋白原2×原液用500μl生长因子鸡尾酒，得到25毫克/毫升纤维蛋白原工作溶液含有生长因子和分装成10或20微升贮存于-70℃。在-70℃下的溶液是稳定的，最多至12个月</li><li>同样，混合500微升的凝血酶倍原液用500μl生长因子鸡尾酒，得到25单位/毫升凝血酶工作液含有生长因子和分装成类似10或20微升卷进行存储一个吨-70℃长达12个月。 </li><li>上接枝的日子，将纤维蛋白原和含凝血酶生长因子鸡尾酒在冰上，直到与细胞混合。 </li></ol> 2，T3脊髓横断<ol><li>用可接受的方法麻醉成年雌性菲舍尔344大鼠或无胸腺裸鼠体内。主题深度麻醉，当反应到尾巴和爪子掐是完全不存在。注：我们通常用150-200克的大鼠菲舍尔或180-220克无胸腺大鼠和氯胺酮麻醉的鸡尾酒（2毫升/千克）（25毫克/毫升），甲苯噻嗪（1.3毫克/毫升）和乙酰丙嗪（0.25毫克/毫升）。 </li><li>适用眼膏，以防止干燥或眼睛的伤害，而动物在麻醉状态下。 </li><li>刮胡子的上胸面积和清洁与优碘皮肤。 </li><li>切使用＃15刀片在皮肤和肌肉，用外科手术牵开器暴露T3椎体，并在T3椎骨执行椎板使用咬骨钳，露出的T3 / 4脊髓。 </li><li>做一个LONgitudinal正中切口在使用＃11刀片大约2毫米长的硬脑膜。 </li><li>将虹膜切除剪硬脑膜下切开右外侧整个脊髓。使在同一侧的另一个切1.5毫米更多cadually。 </li><li>两切段用钝器23号针头连接到中等强度之间的真空吸脊髓组织。使用可视化验证，以确保完全横断腹和横向。这将完成一个侧面半切。 </li><li>为了延长病变为全宽脊髓横断，将镜切口进入左hemicord。试图离开硬脑膜完整，比先切等，嫁接时，两个星期后，保留该公司移植物/纤维蛋白基质中的病变部位。 </li><li>缝合肌肉，应用抗生素粉，主食皮肤。 </li><li>注入乳酸林格氏（3毫升）中，Bannamine（2.5-5毫克/千克）和氨苄青霉素（80-100毫克/千克）手术和脉后，立即（见材料表）ntain大鼠在一个温暖的孵化器，直到体温重新建立。 </li><li>排空膀胱，并每天两次约两个星期注射林格氏和氨苄西林溶液直至建立反射性膀胱排空（ 图1B）。 </li></ol> 3。的新鲜分离胚胎一天准备14脊髓神经干细胞<ol><li>获得近交转基因绿色荧光蛋白F344大鼠（F344-的Tg（UBC-EGFP）F455Rrrc）从大鼠资源研究中心，美国密苏里大学。 </li><li>注射40微克脱-甘氨酸10，[D-丙氨酸6]-促黄体生成激素释放激素乙基酰胺（LHRH）2后，在PBS中稀释，在200的浓度微克/毫升腹膜内（IP）的每成熟雌性大鼠（8周或更老） -3小时光照诱导的胚胎收集的同步。 </li><li>交配成熟的绿色荧光蛋白纯合或杂雄性大鼠过夜注射后4天。 </li><li>收集胚胎在几天13.5-14.5交媾（PC）在冷的HBSS缓冲液，检查下一个“NightSea”手电筒和过滤眼镜（BLS1 - 蓝星手电筒和型号VG1屏障过滤器）GFP表达或荧光显微镜。 </li><li>从每个GFP阳性胎儿解剖脊髓出无菌，取出覆脑膜及附加脊神经节与虹膜切除术剪刀和细珠宝商镊子。 </li><li>收集解剖脊髓中，加入2ml冷的HBSS缓冲液在15毫升cornical管并保持在冰上。 </li><li>按照参考第20到分离解剖脊髓： <ol><li>简单地说，加2毫升0.25％胰蛋白酶-EDTA含有解剖脊髓管（线数可以一起消化，1线可以产生足够的细胞为一个主题的移植物）和消化，在37℃下10-12分钟。 </li><li>停止胰蛋白酶反应通过加入含有10％FBS的管和离心组织于2500 rpm离心2分钟的10ml DMEM。 </li><li>悬浮组织在2毫升Neurobasal培养基合作ntaining 2％B27，以及使用越来越小的火抛光的巴斯德吸管磨碎的脊髓组织。 </li><li>离心将细胞以2,500 rpm离心2分钟，再悬浮于2ml的Neurobasal培养基中含有B27，并用40μm的细胞过滤器过滤器过滤细胞。 </li></ol></li><li>计数细胞，用血细胞计数和分裂细胞同样分为两个Eppendorf管中。 </li><li>离心机的细胞，彻底消除上清液（1-2分钟都必须撤出所有上清液用低真空小费），所以按剩余上清细胞再悬浮后，生长因子鸡尾酒将不会被摊薄。 </li><li>重悬细胞的每一半中含有的生长因子，分别以250,000细胞/微升的浓度（细胞沉淀计数大约⅓最终体积）的纤维蛋白原或凝血酶的工作溶液，并放置在冰上事先移植（ 图1A）。请注意，当与细胞混合纤维蛋白原可能自发地胶前s的凝血酶在病变/移植部位相结合;避免过早胶凝，立刻体内细胞移植前混合细胞中纤维蛋白原。 </li></ol> 4，移植<ol><li>两个星期后脊髓横断Reexpose的损毁T3 / 4脊髓。 </li><li> 5微升纤维蛋白原细胞和5微升凝血酶的细胞可以直接注射到九分，通过密封的疤痕组织和硬脑膜完整病灶部位，而无需重新打开病灶部位。 </li><li>使用27号针头以创建9个孔的疤痕组织和完整硬脑膜1-2周后的病变的表面上：在中心3（一个在中间点和两个支管，并间隔0.5毫米分开），并在这两个延髓3和在尾部接口（大约0.5mm或延髓尾端向病灶中心）3。 </li><li>然后纤维蛋白原细胞溶液体积的一半注入病灶部位和四分之一体积的三个核心点到3点吻端接口和AQ的uarter量为3分尾接口。 </li><li>然后，立即注入throbmbin细胞进入相同的斑点。血纤维蛋白原的细胞和病灶部位内凝血酶细胞的混合物会形成纤维蛋白凝胶，以保持细胞到损伤位点和生长因子鸡尾酒将支持细胞的生存。细胞使用的是连接到一个PicoSpritzer（通用阀门公司）拉玻璃移液管注入。 </li><li>移植培养的人神经干细胞21在与上述相同的程序，利用从人的试剂制成的纤维蛋白和生长因子鸡尾酒。 </li></ol>

<ol>
	<li>Ramon y Cajal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Degeneration+and+regeneration+of+the+nerve+system.">In Degeneration and regeneration of the nerve system.</a> , (1991).</li><li>Jakeman, L. B., Reier, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+projections+between+fetal+spinal+cord+transplants+and+the+adult+rat+spinal+cord:+a+neuroanatomical+tracing+study+of+local+interactions.">Axonal projections between fetal spinal cord transplants and the adult rat spinal cord: a neuroanatomical tracing study of local interactions.</a> J Comp Neurol. 307, 311-334 (1991).</li><li>Bamber, N. I., Li, H., Aebischer, P., Xu, X. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fetal+spinal+cord+tissue+in+mini-guidance+channels+promotes+longitudinal+axonal+growth+after+grafting+into+hemisected+adult+rat+spinal+cords.">Fetal spinal cord tissue in mini-guidance channels promotes longitudinal axonal growth after grafting into hemisected adult rat spinal cords.</a> Neural Plast. 6, 103-121 (1999).</li><li>Theele, D. P., Schrimsher, G. W., Reier, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+growth+and+fate+of+fetal+spinal+iso-+and+allografts+in+the+adult+rat+injured+spinal+cord.">Comparison of the growth and fate of fetal spinal iso- and allografts in the adult rat injured spinal cord.</a> Exp Neurol. 142, 128-143 (1996).</li><li>Giovanini, M. A., Reier, P. J., Eskin, T. A., Wirth, E., Anderson, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+human+fetal+spinal+cord+grafts+in+the+adult+rat+spinal+cord:+influences+of+lesion+and+grafting+conditions.">Characteristics of human fetal spinal cord grafts in the adult rat spinal cord: influences of lesion and grafting conditions.</a> Exp Neurol. 148, 523-543 (1997).</li><li>Wictorin, K., Bj&#246;rklund, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+outgrowth+from+grafts+of+human+embryonic+spinal+cord+in+the+lesioned+adult+rat+spinal+cord.">Axon outgrowth from grafts of human embryonic spinal cord in the lesioned adult rat spinal cord.</a> Neuroreport. 3, 1045-1048 (1992).</li><li>Vroemen, M., Aigner, L., Winkler, J., Weidner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+neural+progenitor+cell+grafts+survive+after+acute+spinal+cord+injury+and+integrate+along+axonal+pathways.">Adult neural progenitor cell grafts survive after acute spinal cord injury and integrate along axonal pathways.</a> Eur J Neurosci. 18, 743-751 (2003).</li><li>Blits, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vector-mediated+transduction+of+neural+progenitor+cells+before+implantation+into+injured+spinal+cord+and+brain+to+detect+their+migration,+deliver+neurotrophic+factors+and+repair+tissue.">Lentiviral vector-mediated transduction of neural progenitor cells before implantation into injured spinal cord and brain to detect their migration, deliver neurotrophic factors and repair tissue.</a> Restor Neurol Neurosci. 23, 313-324 (2005).</li><li>Lepore, A. C., Fischer, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage-restricted+neural+precursors+survive,+migrate,+and+differentiate+following+transplantation+into+the+injured+adult+spinal+cord.">Lineage-restricted neural precursors survive, migrate, and differentiate following transplantation into the injured adult spinal cord.</a> Exp Neurol. 194, 230-242 (2005).</li><li>Gaillard, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reestablishment+of+damaged+adult+motor+pathways+by+grafted+embryonic+cortical+neurons.">Reestablishment of damaged adult motor pathways by grafted embryonic cortical neurons.</a> Nat Neurosci. 10, 1294-1299 (2007).</li><li>Remy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+lines+of+GFP+transgenic+rats+relevant+for+regenerative+medicine+and+gene+therapy.">New lines of GFP transgenic rats relevant for regenerative medicine and gene therapy.</a> Transgenic Res. 19, 745-763 (2010).</li><li>Cao, Q. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cells+engrafted+into+the+normal+or+lesioned+adult+rat+spinal+cord+are+restricted+to+a+glial+lineage.">Pluripotent stem cells engrafted into the normal or lesioned adult rat spinal cord are restricted to a glial lineage.</a> Exp Neurol. 167, 48-58 (2001).</li><li>Mothe, A. J., Kulbatski, I., Parr, A., Mohareb, M., Tator, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+spinal+cord+stem/progenitor+cells+transplanted+as+neurospheres+preferentially+differentiate+into+oligodendrocytes+in+the+adult+rat+spinal+cord.">Adult spinal cord stem/progenitor cells transplanted as neurospheres preferentially differentiate into oligodendrocytes in the adult rat spinal cord.</a> Cell Transplant. 17, 735-751 (2008).</li><li>Bryda, E. C., Pearson, M., Agca, Y., Bauer, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+detection+and+identification+of+multiple+chromosomal+integration+sites+in+transgenic+animals+created+with+lentivirus.">Method for detection and identification of multiple chromosomal integration sites in transgenic animals created with lentivirus.</a> Biotechniques. 41, 715-719 (2006).</li><li>Willerth, S. M., Faxel, T. E., Gottlieb, D. I., Sakiyama-Elbert, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+soluble+growth+factors+on+embryonic+stem+cell+differentiation+inside+of+fibrin+scaffolds.">The effects of soluble growth factors on embryonic stem cell differentiation inside of fibrin scaffolds.</a> Stem Cells. 25, 2235-2244 (2007).</li><li>Grumbles, R. M., Sesodia, S., Wood, P. M., Thomas, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophic+factors+improve+motoneuron+survival+and+function+of+muscle+reinnervated+by+embryonic+neurons.">Neurotrophic factors improve motoneuron survival and function of muscle reinnervated by embryonic neurons.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 68, 736-746 (2009).</li><li>Kadoya, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+intrinsic+and+extrinsic+neuronal+mechanisms+facilitate+bridging+axonal+regeneration+one+year+after+spinal+cord+injury.">Combined intrinsic and extrinsic neuronal mechanisms facilitate bridging axonal regeneration one year after spinal cord injury.</a> Neuron. 64, 165-172 (2009).</li><li>Lu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-distance+growth+and+connectivity+of+neural+stem+cells+after+severe+spinal+cord+injury.">Long-distance growth and connectivity of neural stem cells after severe spinal cord injury.</a> Cell. 150, 1264-1273 (2012).</li><li>Coumans, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+regeneration+and+functional+recovery+after+complete+spinal+cord+transection+in+rats+by+delayed+treatment+with+transplants+and+neurotrophins.">Axonal regeneration and functional recovery after complete spinal cord transection in rats by delayed treatment with transplants and neurotrophins.</a> J Neurosci. 21 (23), 9334-9344 (2001).</li><li>Harris, J., Lee, H., Tu, C. T., Cribbs, D., Cotman, C., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparing+e18+cortical+rat+neurons+for+compartmentalization+in+a+microfluidic+device.">Preparing e18 cortical rat neurons for compartmentalization in a microfluidic device.</a> J Vis Exp. (305), (2007).</li><li>Yan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+neuronal+differentiation+of+human+neural+stem+cell+grafts+in+adult+rat+spinal+cord.">Extensive neuronal differentiation of human neural stem cell grafts in adult rat spinal cord.</a> PLoS Med. 4 (2), e39 (2007).</li><li>Popovich, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+bridges+for+spinal+cord+repair.">Building bridges for spinal cord repair.</a> Cell. 150 (6), 1105-1106 (2012).</li><li>Catelas, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrin.">Fibrin.</a> Comprehensive Biomaterials. 2, 303-328 (2011).</li><li>Petter-Puchner, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+long-term+neurocompatibility+of+human+fibrin+sealant+and+equine+collagen+as+biomatrices+in+experimental+spinal+cord+injury.">The long-term neurocompatibility of human fibrin sealant and equine collagen as biomatrices in experimental spinal cord injury.</a> Exp Toxicol Pathol. 58, 237-245 (2007).</li><li>Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+neural+stem+cells.">Mammalian neural stem cells.</a> Science. 287, 1433-1438 (2000).</li><li>Deister, C., Schmidt, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+neurotrophic+factor+combinations+for+neurite+outgrowth.">Optimizing neurotrophic factor combinations for neurite outgrowth.</a> Journal of Neural Engineering. 3, 172-179 (2006).</li></ol>

我们什么都没有透露。

一个用于NSC移植在脊髓损伤的主要障碍是生存于病灶中心不佳。在病灶部位的任何间隙或腔体有可能减少或削弱棘上轴突和下方的伤害分离的脊髓节段之间的功能神经元中继的形成。另外，移植的神经干细胞存活不佳可能影响其与宿主组织整合，并因此减少移植神经元与神经元的主机的连通性。可能的机制来解释细胞的损失包括急性脊髓损伤产生的细胞毒性环境中，主机脊髓继发变性，受伤的区?...

脊髓损伤（SCI）往往损害不仅白质束携带的信号和从脑，而且中央灰质，引起的interneurons和运动神经元的节段性损失。脊髓损伤的后果是两个马达和病变以下感觉功能的丧失。不幸的是，成人中枢神经系统（CNS）不自发地再生，从而产生永久功能缺损1。因此，重建受伤的成年脊髓和改进运动，感觉和植物神经功能是脊髓损伤研究的一个重要目标。神经干细胞（NS​​Cs），无论是从胚胎或成年中枢神经系统中直接分离，是引人注目的候选细胞，以取代失去的神经元和神经胶质细胞。此外，这些细胞具有形成新的功能性继电器跨越病变部位2,3恢复轴突传导的潜力。 迄今为止，还没有解剖的详细阐释，electrophysiological和神经元中继形成了神经干细胞移植的重度脊髓损伤后行为的影响。有几个原因：第一，移植的神经干细胞或胎儿中枢神经系统组织中存活不佳时，嫁接到大病灶腔。以往的研究表明大量的早期细胞脱落，留下大空囊状病灶腔4,5。在一些研究中移植的细胞随后会分裂，并填写病灶腔4,5，但几天到几周的延迟之后这可能会发生，以及随后病灶部位填充可能不完整或一致的。其次，高效的跟踪系统，可提供对细胞存活，分化/成熟，并移植神经干细胞生长的声音数据缺乏。大多数早期的研究采用顺行和逆行标记来跟踪从移植2,3轴突的预测。然而，这些技术只是部分，往往从移植细胞所产生的标记不清轴突预测及示踪方法都是主观吨引起的染料泄漏以外植入的细胞的工件。其他组的人使用特定的神经元标记物来标记人类胎儿神经干细胞到受伤的啮齿类动物脊髓5,6移 ​​植后轴突的预测。然而，在这些研究中， 移植并没有一贯良好的生存。最近，病毒递送的GFP报告基因的用于标记培养的神经干细胞7,8。但是，GFP的表达常常不一致，并且可以下调7。最近，利用转基因供体小鼠或大鼠稳定表达报告基因，绿色荧光蛋白，或人胎盘碱性磷酸酶，已显着提高体内 9,11移植的神经干细胞/祖细胞的跟踪。第三，一些研究表明，无论从胚胎或成年中枢神经系统导出体外培养的大鼠神经干细胞完全分化成神经胶质谱系当移植到完整的或受伤的成年脊髓心病的环境ð7,12,13，尽管事实是这些神经干细胞能够分化成神经元和神经胶质细胞在体外的，这表明局部环境可能要求干细胞的命运。可选地，培养的神经干细胞，尤其是那些从成年CNS衍生的，可具有固有defaulty属性分化为体内 13胶质谱系。 因为上面所讨论的限制，我们小组最近开发出一种新的协议，以提高胚胎NSC跟踪，生存，并在严重受伤的成年脊髓分化/成熟。简单地说，我们开始与表达绿色荧光蛋白报告基因在体内移植后14支撑GFP表达一个稳定的转基因菲舍尔344大鼠自交系。接下来，我们使用新鲜分离的神经干细胞从胚胎第14天菲舍尔344脊髓，发展阶段，其保存以产生神经元和神经胶质细胞的潜力。最后，我们的嵌入式新鲜分离的神经干细胞成含增长纤维蛋白基质因素15-17保留了细胞和均匀的大病灶腔内散发，旨在支持移植细胞的存活，分化和整合。移植物置入的T3完全横断，脊髓损伤后两星期网站。这些移植细胞始终充满完全横断网站和分化成神经元丰富的扩展大量的轴突到宿主脊髓长距离18。类似的结果用培养的人神经干细胞移植到免疫缺陷大鼠18获得的。

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Reagents</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue</td>
 <td>Comment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fibrinogen(rat)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>F6755-25MG</td>
 <td>2 hr at 37 &deg;C to dissovle 
 Stock Concentration: 50 mg/ml 
 Final Concentration: 25 mg/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Thrombin (rat)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>T5772-100UN</td>
 <td>Dissovle in 10 mM CaCl2 
 Stock Concentration: 50 U/ml 
 Final Concentration: 25 mg/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>bFGF (human)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>F0291 (25 &mu;g)</td>
 <td>Stock Concentration: 200 ng/&mu;l 
 Final Concentration: 10 ng/&mu;l</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EGF (murine)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>E1257 (0.1 mg)</td>
 <td>Stock Concentration: 200 ng/&mu;l 
 Final Concentration: 10 ng/&mu;l</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BDNF(human)</td>
 <td>Peprotech</td>
 <td>452-02 (1 mg)</td>
 <td>Stock Concentration: 1000 ng/&mu;l 
 Final Concentration: 50 ng/&mu;l</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NT-3 (human)</td>
 <td>Peprotech</td>
 <td>452-03 (1 mg)</td>
 <td>Stock Concentration: 1000 ng/&mu;l 
 Final Concentration: 50 ng/&mu;l</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>GDNF (rat)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>G1401 (10 &mu;g)</td>
 <td>Stock Concentration: 200 ng/&mu;l 
 Final Concentration: 10 ng/&mu;l</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>IGF-1(mouse)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>I8779 (50 &mu;g)</td>
 <td>Stock Concentration: 200 ng/&mu;l 
 Final Concentration: 10 ng/&mu;l</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>aFGF (human)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>F5542 (25 &mu;g)</td>
 <td>Stock Concentration: 200 ng/&mu;l 
 Final Concentration: 10 ng/&mu;l </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PDGF-AA (human)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>P3076 (10 &mu;g)</td>
 <td>Stock Concentration: 200 ng/&mu;l 
 Final Concentration: 10 ng/&mu;l</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HGF (human)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>H9661 (5 &mu;g)</td>
 <td>Stock Concentration: 200 ng/&mu;l 
 Final Concentration: 10 ng/&mu;l</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MDL28170</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>M6690 (25 mg)</td>
 <td>Stock in DMSO 
 Stock Concentration: 1 mM 
 Final Concentration: 50 &mu;M</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PBS</td>
 <td>Millipore</td>
 <td>BSS-1005-B</td>
 <td>Stock Concentration: 1X 
 Final Concentration: 1X</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DMSO</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>D2650</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ketamine</td>
 <td>Putney</td>
 <td>26637-411-01</td>
 <td>40-80 mg/kg 
 Stock Concentration: 100 mg/ml 
 Final Concentration: 25 mg/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Xylazine</td>
 <td>Lloyd</td>
 <td>0410,</td>
 <td>2.5-8 mg/ml 
 Stock Concentration: 100 mg/ml 
 Final Concentration: 1.3 mg/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Acepromazine</td>
 <td>Butler</td>
 <td>003845</td>
 <td>0.5-4 mg/ml 
 Stock Concentration: 10 mg/ml 
 Final Concentration: 0.25 mg/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Betadine</td>
 <td>Healthpets</td>
 <td>BET16OZ</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ringers</td>
 <td>Abbott</td>
 <td>04860-04-10</td>
 <td>2-3 ml/inj</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Banamine</td>
 <td>Schering-Plough</td>
 <td>0061-0851-03</td>
 <td>2.5 -5 mg/kg 
 Stock Concentration: 50 mg/ml 
 Final Concentration: 0.5 mg/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ampicillin</td>
 <td>Sandoz</td>
 <td>0781-3404-85</td>
 <td>80-100 mg/kg 
 Final Concentration: 50 mg/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>LH-RH</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>L4513</td>
 <td>200 &mu;g/kg 
 Final Concentration: 200 &mu;g/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HBSS</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>14175-096</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Trypsin</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>25200056 </td>
 <td>Stock Concentration: 0.25 % 
 Final Concentration: 0.125 %</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DMEM</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>11995073 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>FBS</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>16000044 </td>
 <td>Stock Concentration: 100 % 
 Final Concentration: 10 %</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Neurobasal Medium</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>21103049 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>B27</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>17504044</td>
 <td>Stock Concentration: 100x 
 Final Concentration: 1x</td>
 </tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Note, use human reagents for grafts of human NSCs</td>
 </tbody>
</table>

promotion of survival and differentiation of neural stem cells with fibrin and growth factor cocktails after severe spinal cord injury

神经干细胞（NS​​Cs）能自我更新和分化成神经元和神经胶质细胞。移植的神经干细胞可以脊髓损伤（SCI）后替代丢失的神经元和神经胶质细胞，并能形成功能性继电器重新连接的上方和下方的病变脊髓节段。以前的研究接枝神经干细胞已经被不完全移植物存活的脊髓损伤腔内的限制。另外，接枝细胞存活，分化和扩展过程跟踪没有被优化。最后，在以往的研究，培养的大鼠神经干细胞通常报告分化成神经胶质细胞在移植到损伤脊髓，而不是神经元，除非命运被驱赶到一个特定的细胞类型。为了解决这些问题，我们开发了新的方法，以提高神经干细胞的存活，整合和分化，甚至严重的脊髓损伤部位。神经干细胞是新鲜从表达绿色佛罗里达州一个稳定的转基因菲舍尔344大鼠行胚胎第14天脊髓（E14）隔离uorescent蛋白（GFP），并嵌入到含有生长因子的纤维蛋白基质;该制剂的目的是保留移植细胞在病灶腔和支持细胞的生存。神经干细胞在纤维蛋白/生长因子鸡尾酒植入两周后胸3级（T3）完全性脊髓横断，从而避免炎症的高峰期。导致移植物完全充满病灶腔和分化为两个神经元，轴突延伸到宿主脊髓过相当长的距离，和神经胶质细胞。培养的人神经干细胞表达绿色荧光蛋白移植物导致类似的结果。因此，方法被定义为提高神经干细胞移植，存活和体内研究结果的分析。

的GFP免疫组织化学标记表明接枝的大鼠神经干细胞重新悬浮于磷酸盐缓冲盐水（PBS）（缺乏纤维蛋白基质和生长因子），在T3切断现场不良存活，只有附着在病灶/主机余量，留下大部分病灶部位的空的无移植的细胞（ 图2A）。神经干细胞的存活改善时共接枝与单独的纤维蛋白基质，但接枝并没有完全填满一个大腔病变（数据未显示）。因此，我们嵌入到神经干细胞含有生长因子鸡尾?...

Watch this Scientific Journal Video about Promotion of Survival and Differentiation of Neural Stem Cells with Fibrin and Growth Factor Cocktails after Severe Spinal Cord Injury at JoVE.com

Promotion of Survival and Differentiation of Neural Stem Cells with Fibrin and Growth Factor Cocktails after Severe Spinal Cord Injury

含有生长因子的纤维蛋白基质被用来留住嫁接神经干细胞分化为完全脊髓横断网站。移植细胞完全充满病灶腔和分化为多种神经细胞类型，包括神经元轴突延伸到宿主脊髓长距离。

促进存活神经干细胞与纤维蛋白和生长因子鸡尾酒和分化的严重脊髓损伤后

Neural stem cells (NSCs) can self-renew and differentiate into neurons and glia. Transplanted NSCs can replace lost neurons and glia after spinal cord ...

promotion-survival-differentiation-neural-stem-cells-with-fibrin

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.3K 次观看.  Veterans Administration Medical Center, San Diego. 含有生长因子的纤维蛋白基质被用来留住嫁接神经干细胞分化为完全脊髓横断网站。移植细胞完全充满病灶腔和分化为多种神经细胞类型，包括神经元轴突延伸到宿主脊髓长距离。 