אנו מודים למשאב לעכברוש ומרכז מחקר, אוניברסיטת מיזורי, קולומביה, מיזורי, למתן חולדות GFP; Neuralstem בע&quot;מ לאספקת תאי גזע עצביים של אדם. עבודה זו נתמכה על ידי המינהל הוותיקים, NIH (NS09881), מנהל מחקר בעמוד השדרה בקנדה, קרן קרייג ח נילסן, וברנרד וקרן הצדקה אן שפיצר.

כל הפרוטוקולים של בעלי החיים מאושרים על ידי VA-סן דייגו המוסדית טיפול בבעלי חיים ועדת שימוש (IACUC). הנחיות NIH לטיפול בבעלי חיים במעבדה ובטיחות הן אחריו בקפדנות. לבעלי חיים יש גישה חופשית למזון ומים לאורך כל תקופת המחקר ומטופלים כראוי למזעור כאב ואי נוחות. 1. הכנת פיברין הרכיבים המכילה קוקטיילי גורם גדילה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים פיברינוגן החולדה 25 מ&quot;ג ב0.5 מיליליטר PBS להשיג 50 מ&quot;ג / מיליליטר 2x פתרון מניות (ראה טבלת חומרים). פיברינוגן קשה לפזר וצריך להיות ממוקם ב37 מעלות צלזיוס חממה או waterbath ומזועזע כל דקות 5-10 ל1-2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים 100 תרומבין החולדה האו&quot;ם ב2 מיליליטר של 10 מ&quot;מ CaCl סטרילי 2 כדי להשיג את 50 U / ml 2x פתרון מניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים גורמי גדילה ב-PBS בריכוזים הבאים כדי לקבל פתרון 100 מניית μl: 1 מ&quot;ג / מיליליטר: BDNF; NT-3 (ריכוז המניה גבוה כמו עירוי intrathecal in vivo <sup&gt; 19); 200 מיקרוגרם / מיליליטר: GDNF; IGF; bFGF; EGF; PDGF; aFGF; HGF (כ -1,000 x גבוה יותר מאשר משמש לתרבית תאים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים 25 MDL28170 מ&quot;ג (מעכב calpain) ב1.3 מיליליטר DMSO להשיג 50 פתרון מניות מ&quot;מ DMSO, ואז לדלל 50x בPBS להשיג פתרון מניות 1 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את כל רכיב גורם גדילה 100 μl ושל MDL28170 (פתרון מניות 1 מ&quot;מ) 100 μl לייצר פתרון קוקטייל גורם גדילת 1,000 μl (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 500 פתרון מניות μl פיברינוגן 2x עם 500 קוקטייל גורם גדילת μl להשיג פתרון 25 מ&quot;ג / מיליליטר פיברינוגן עבודה המכיל גורמי גדילה וaliquot לתוך 10 או 20 μl לאחסון ב -70 ° C. הפתרון הוא יציב עד 12 חודשים ב -70 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדומה לכך, לערבב פתרון 2x המניה 500 תרומבין μl עם 500 קוקטייל גורם גדילת μl להשיג 25 פתרון עובד U / תרומבין מיליליטר המכיל גורמי גדילה וaliquot לתוך כרכי 10 או 20 μl דומים לאחסוןלא -70 עד מעלות צלזיוס במשך 12 חודשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום ההשתלה, הנח קוקטיילים פיברינוגן וגורם גדילה המכיל תרומבין על קרח עד מעורבב עם תאים. </li></ol> 2. חיתוך רוחב חוט השדרה T3 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי נקבה בוגרת חולדות פישר 344 או חולדות בעירום athymic תוך שימוש בשיטות מקובלות. נושאים עמוקים מורדמים, כאשר היענות לזנב וקמצוץ כפה נעדרות לחלוטין. הערה: אנו משתמשים בדרך כלל 150-200 חולדות גרם פישר או 180-220 גרם חולדות athymic, וקוקטייל הרדמה (2 מיליליטר / קילוגרם) של קטמין (25 מ&quot;ג / מיליליטר), xylazine (1.3 מ&quot;ג / מיליליטר) וacepromazine (0.25 מ&quot;ג / מיליליטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל משחה העין כדי למנוע יובש או פציעתם של עיניים ואילו בעלי החיים נמצאים תחת הרדמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגלח את אזור בית החזה העליון ולנקות את העור עם פולידין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את העור ושרירים באמצעות # 15 להב, לחשוף חוליה T3 באמצעות מפשק כירורגית, ולבצע laminectomy בחולית T3 לחשוף T3 / 4 חוט השדרה באמצעות rongeur. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך לוןחתך קו האמצע gitudinal בדורה של כ -2 מ&quot;מ אורך באמצעות סכין # 11. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח המספריים iridectomy מתחת הדורה לחתוך את חוט השדרה כולו לרוחב הנכון. לעשות חתך נוסף באותו הצד 1.5 מ&quot;מ יותר cadually. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רקמת חוט השדרה לשאוב בין שני מגזרים לחתוך עם מחט G בוטה 23 מחוברת לואקום בעצימות בינוני. השתמש באימות חזותית על מנת להבטיח חיתוך רוחב מלא ventrally ורוחבי. זה ישלים hemisection לרוחב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להאריך את הנגע לחיתוך רוחב חוט השדרה ברוחב מלא, הנח חתכים ראי לhemicord השמאל. תנסה לעזוב את הדורה ללא פגע, מלבד החתך הראשון, כדי לשמר את מטריצת השתל / הפיברין חברה באתר הנגע כאשר השתילו שבועיים מאוחר יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תפר את השרירים, להחיל אבקת אנטיביוטיקה ומרכיב עיקרי בעור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק (3 מיליליטר) של רינגר לקטט, Bannamine (2.5-5 מ&quot;ג / קילוגרם) ואמפיצילין (80-100 מ&quot;ג / קילוגרם) (ראה טבלת חומרים) מייד לאחר הניתוח ומאיחולדות ntain בחממה חמה עד ויסות החום הוא הוקם מחדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוקן את שלפוחית ​​השתן ולהזריק את הפתרון של רינגר ואמפיצילין פעמיים ביום במשך כשבועיים, עד להקמת שלפוחית ​​רפלקס ריקון (איור 1). </li></ol> 3. הכנת טרי היום עוברי ניתק 14 חוט השדרה עצבית תאי גזע <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג חולדות F344-GFP מהונדסים משפחת מזדווגים (F344-TG (UBC-EGFP) F455Rrrc) מעכברוש משאבים ומרכז מחקר, אוניברסיטת מיזורי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק 40 מיקרוגרם des-גלאי 10, [D-עלא 6]-Leuteinizing הורמון משחרר הורמון Ethylamide (LHRH) מדולל PBS בריכוז של 200 מיקרוגרם / intraperitoneally מ&quot;ל (IP) לחולדה בוגרת נשית (8 שבועות ומעלה) לאחר 2 אינדוקציה אור hr -3 לסנכרון של אוסף עובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזדווג עם לילה בוגר GFP הומוזיגוטים או הטרוזיגוטיים זכר חולדה 4 ימים לאחר ההזרקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף עובר בימים 13.5-14.5 postcoitus(PC) במאגר HBSS קר, לבחון את הביטוי של GFP תחת משקפיים פנס ומסנן &quot;NightSea&quot; (BLS1 - BlueStar פנס ומסנן מחסום הדגם VG1) או מיקרוסקופ פלואורסצנטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח חוט השדרה מתוך סביבה נקיה מחיידקים מעובר GFP החיובי ולהסיר את קרומי המוח שמעל וגרעיני השדרה מצורפים עם מספריים iridectomy ומלקחי תכשיטנים בסדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את מיתרי השדרה גזורים לתוך 2 חיץ HBSS קר מיליליטר בצינור cornical 15 מ&quot;ל ולשמור על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עקוב התייחסות # 20 לנתק את מיתרי השדרה גזורים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצרה, להוסיף 2 מיליליטר של 0.25% טריפסין-EDTA לצינור המכיל מיתרי השדרה גזורים (ניתן לעכל כמה חוטים יחד, כבל 1 יכול לייצר מספיק תאים להשתלה של נושא אחד) ולעכל ב37 מעלות צלזיוס למשך 10-12 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעצור את תגובת טריפסין על ידי הוספת 10 מיליליטר של DMEM המכיל FBS 10% לצינור צנטריפוגות הרקמות ב2,500 סל&quot;ד במשך 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend רקמות ב2 מיליליטר שיתוף בינוני neurobasalntaining 2% B27, וtriturate רקמת חוט השדרה באמצעות pipets פסטר אש מלוטש בהדרגה קטנה יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה התאים ב 2,500 סל&quot;ד במשך 2 דקות, resuspend ב 2 מיליליטר של מדיום neurobasal המכיל B27, ותאי סינון עם מסננת מסנן תא 40 מיקרומטר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת התאים עם hemocytometer ולחלק את התאים באופן שווה לשני צינורות Eppendorf. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה התאים ולהסיר לחלוטין את supernatant (1-2 דקות נדרשות להסיג את כל supernatant עם טיפ ואקום נמוך) ולכן הקוקטיילים גורם גדילה לא ידוללו על ידי supernatant שנותר לאחר התא מחדש השעיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend כל מחצית התאים בפיברינוגן או הפתרון עובד תרומבין המכיל גורמי גדילה, בהתאמה, בריכוז של 250,000 תאים / μl (ספירות תא גלולה במשך כ ⅓ נפח סופי) ומניח אותם על השתלה לפני קרח (איור 1 א). הערה פיברינוגן שעשוי באופן ספונטני ג&#39;ל כאשר מעורבבים עם תאs לפני שילוב עם תרומבין באתר נגע / שתל; כדי להימנע מgellation המוקדם, לערבב תאים בפיברינוגן מייד לפני השתלת תאים בגוף חי. </li></ol> 4. השתלות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Reexpose חוט השדרה lesioned T3 / 4 שבועיים לאחר חיתוך רוחב של חוט השדרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 5 פיברינוגן-תאים μl ו5 תרומבין-תאי μl יכולים להיות מוזרקים ישירות לתשע נקודות של אתר הנגע באמצעות רקמת צלקת אטומה ודורה שלמה ללא פתיחה מחדש אתר הנגע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במחט G 27 ליצור 9 חורים על פני השטח של רקמת הצלקת ודורה ללא פגע לאחר 1-2 שבועות נגע: 3 במרכז (אחד בנקודת אמצע ושניים בlaterals, ומרווחי 0.5 מ&quot;מ בנפרד) ו 3 בשני מקורי ו3 בממשק הזנב (כ 0.5 מ&quot;מ מקורי או הזנב למרכז של הנגע). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אז מזריק מחצית נפח של פתרון תא פיברינוגן לשלוש נקודות של אתר הנגע ורבע נפח מרכזיים ל3 נקודות של הממשק וaq מקוריuarter נפח ל -3 נקודות של ממשק הזנב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ואז, מייד להזריק תאי throbmbin לאותם מקומות. התערובת של תאי פיברינוגן ותאי תרומבין בתוך אתר הנגע תהווה ג&#39;ל הפיברין להחזיק תאים לתוך אתר נגע וקוקטיילי גורם הגדילה יתמכו בהישרדות של תאים. תאים מוזרקים באמצעות טפטפות זכוכית משך מחוברת לPicospritzer (כללי Valve, Inc). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> NSCs השתלות התרבותי אנושי 21 באותו ההליך שתואר לעיל, ולהשתמש בקוקטיילי הפיברין וגורם גדילה עשויים מחומרים כימיים אדם. </li></ol>

<ol>
	<li>Ramon y Cajal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Degeneration+and+regeneration+of+the+nerve+system.">In Degeneration and regeneration of the nerve system.</a> , (1991).</li><li>Jakeman, L. B., Reier, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+projections+between+fetal+spinal+cord+transplants+and+the+adult+rat+spinal+cord:+a+neuroanatomical+tracing+study+of+local+interactions.">Axonal projections between fetal spinal cord transplants and the adult rat spinal cord: a neuroanatomical tracing study of local interactions.</a> J Comp Neurol. 307, 311-334 (1991).</li><li>Bamber, N. I., Li, H., Aebischer, P., Xu, X. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fetal+spinal+cord+tissue+in+mini-guidance+channels+promotes+longitudinal+axonal+growth+after+grafting+into+hemisected+adult+rat+spinal+cords.">Fetal spinal cord tissue in mini-guidance channels promotes longitudinal axonal growth after grafting into hemisected adult rat spinal cords.</a> Neural Plast. 6, 103-121 (1999).</li><li>Theele, D. P., Schrimsher, G. W., Reier, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+growth+and+fate+of+fetal+spinal+iso-+and+allografts+in+the+adult+rat+injured+spinal+cord.">Comparison of the growth and fate of fetal spinal iso- and allografts in the adult rat injured spinal cord.</a> Exp Neurol. 142, 128-143 (1996).</li><li>Giovanini, M. A., Reier, P. J., Eskin, T. A., Wirth, E., Anderson, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+human+fetal+spinal+cord+grafts+in+the+adult+rat+spinal+cord:+influences+of+lesion+and+grafting+conditions.">Characteristics of human fetal spinal cord grafts in the adult rat spinal cord: influences of lesion and grafting conditions.</a> Exp Neurol. 148, 523-543 (1997).</li><li>Wictorin, K., Bj&#246;rklund, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+outgrowth+from+grafts+of+human+embryonic+spinal+cord+in+the+lesioned+adult+rat+spinal+cord.">Axon outgrowth from grafts of human embryonic spinal cord in the lesioned adult rat spinal cord.</a> Neuroreport. 3, 1045-1048 (1992).</li><li>Vroemen, M., Aigner, L., Winkler, J., Weidner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+neural+progenitor+cell+grafts+survive+after+acute+spinal+cord+injury+and+integrate+along+axonal+pathways.">Adult neural progenitor cell grafts survive after acute spinal cord injury and integrate along axonal pathways.</a> Eur J Neurosci. 18, 743-751 (2003).</li><li>Blits, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vector-mediated+transduction+of+neural+progenitor+cells+before+implantation+into+injured+spinal+cord+and+brain+to+detect+their+migration,+deliver+neurotrophic+factors+and+repair+tissue.">Lentiviral vector-mediated transduction of neural progenitor cells before implantation into injured spinal cord and brain to detect their migration, deliver neurotrophic factors and repair tissue.</a> Restor Neurol Neurosci. 23, 313-324 (2005).</li><li>Lepore, A. C., Fischer, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage-restricted+neural+precursors+survive,+migrate,+and+differentiate+following+transplantation+into+the+injured+adult+spinal+cord.">Lineage-restricted neural precursors survive, migrate, and differentiate following transplantation into the injured adult spinal cord.</a> Exp Neurol. 194, 230-242 (2005).</li><li>Gaillard, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reestablishment+of+damaged+adult+motor+pathways+by+grafted+embryonic+cortical+neurons.">Reestablishment of damaged adult motor pathways by grafted embryonic cortical neurons.</a> Nat Neurosci. 10, 1294-1299 (2007).</li><li>Remy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+lines+of+GFP+transgenic+rats+relevant+for+regenerative+medicine+and+gene+therapy.">New lines of GFP transgenic rats relevant for regenerative medicine and gene therapy.</a> Transgenic Res. 19, 745-763 (2010).</li><li>Cao, Q. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cells+engrafted+into+the+normal+or+lesioned+adult+rat+spinal+cord+are+restricted+to+a+glial+lineage.">Pluripotent stem cells engrafted into the normal or lesioned adult rat spinal cord are restricted to a glial lineage.</a> Exp Neurol. 167, 48-58 (2001).</li><li>Mothe, A. J., Kulbatski, I., Parr, A., Mohareb, M., Tator, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+spinal+cord+stem/progenitor+cells+transplanted+as+neurospheres+preferentially+differentiate+into+oligodendrocytes+in+the+adult+rat+spinal+cord.">Adult spinal cord stem/progenitor cells transplanted as neurospheres preferentially differentiate into oligodendrocytes in the adult rat spinal cord.</a> Cell Transplant. 17, 735-751 (2008).</li><li>Bryda, E. C., Pearson, M., Agca, Y., Bauer, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+detection+and+identification+of+multiple+chromosomal+integration+sites+in+transgenic+animals+created+with+lentivirus.">Method for detection and identification of multiple chromosomal integration sites in transgenic animals created with lentivirus.</a> Biotechniques. 41, 715-719 (2006).</li><li>Willerth, S. M., Faxel, T. E., Gottlieb, D. I., Sakiyama-Elbert, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+soluble+growth+factors+on+embryonic+stem+cell+differentiation+inside+of+fibrin+scaffolds.">The effects of soluble growth factors on embryonic stem cell differentiation inside of fibrin scaffolds.</a> Stem Cells. 25, 2235-2244 (2007).</li><li>Grumbles, R. M., Sesodia, S., Wood, P. M., Thomas, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophic+factors+improve+motoneuron+survival+and+function+of+muscle+reinnervated+by+embryonic+neurons.">Neurotrophic factors improve motoneuron survival and function of muscle reinnervated by embryonic neurons.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 68, 736-746 (2009).</li><li>Kadoya, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+intrinsic+and+extrinsic+neuronal+mechanisms+facilitate+bridging+axonal+regeneration+one+year+after+spinal+cord+injury.">Combined intrinsic and extrinsic neuronal mechanisms facilitate bridging axonal regeneration one year after spinal cord injury.</a> Neuron. 64, 165-172 (2009).</li><li>Lu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-distance+growth+and+connectivity+of+neural+stem+cells+after+severe+spinal+cord+injury.">Long-distance growth and connectivity of neural stem cells after severe spinal cord injury.</a> Cell. 150, 1264-1273 (2012).</li><li>Coumans, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+regeneration+and+functional+recovery+after+complete+spinal+cord+transection+in+rats+by+delayed+treatment+with+transplants+and+neurotrophins.">Axonal regeneration and functional recovery after complete spinal cord transection in rats by delayed treatment with transplants and neurotrophins.</a> J Neurosci. 21 (23), 9334-9344 (2001).</li><li>Harris, J., Lee, H., Tu, C. T., Cribbs, D., Cotman, C., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparing+e18+cortical+rat+neurons+for+compartmentalization+in+a+microfluidic+device.">Preparing e18 cortical rat neurons for compartmentalization in a microfluidic device.</a> J Vis Exp. (305), (2007).</li><li>Yan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+neuronal+differentiation+of+human+neural+stem+cell+grafts+in+adult+rat+spinal+cord.">Extensive neuronal differentiation of human neural stem cell grafts in adult rat spinal cord.</a> PLoS Med. 4 (2), e39 (2007).</li><li>Popovich, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+bridges+for+spinal+cord+repair.">Building bridges for spinal cord repair.</a> Cell. 150 (6), 1105-1106 (2012).</li><li>Catelas, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrin.">Fibrin.</a> Comprehensive Biomaterials. 2, 303-328 (2011).</li><li>Petter-Puchner, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+long-term+neurocompatibility+of+human+fibrin+sealant+and+equine+collagen+as+biomatrices+in+experimental+spinal+cord+injury.">The long-term neurocompatibility of human fibrin sealant and equine collagen as biomatrices in experimental spinal cord injury.</a> Exp Toxicol Pathol. 58, 237-245 (2007).</li><li>Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+neural+stem+cells.">Mammalian neural stem cells.</a> Science. 287, 1433-1438 (2000).</li><li>Deister, C., Schmidt, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+neurotrophic+factor+combinations+for+neurite+outgrowth.">Optimizing neurotrophic factor combinations for neurite outgrowth.</a> Journal of Neural Engineering. 3, 172-179 (2006).</li></ol>

יש לנו מה למסור.

אחד המכשולים העיקריים להשתלה המל&quot;ל בחוט השדרה נפגע הוא הישרדות עניות במרכז הנגע. כל פערים או חללים באתר הנגע העלול להפחית או להחליש את היווצרות של ממסרים עצביים פונקציונליים בין האקסונים supraspinal ומגזרים בחוט השדרה נפרדים מתחת לפציעה. בנוסף, הישרדות ירודה של NSCs מורכ...

פגיעה בחוט השדרה (SCI) לעתים קרובות נזקים לא רק שטחי חומר לבנים שנושאים אותות ומהמוח, אלא גם את החומר אפור המרכזי, גורמים לאובדן מגזרי של interneurons והנוירונים מוטוריים. התוצאה של SCI היא אובדן של שניהם מוטוריים ותפקוד חושי מתחת לנגע. למרבה הצער, המערכת למבוגרים העצבים המרכזית (CNS) לא באופן ספונטני להתחדש, וכתוצאה מליקויים תפקודיים קבועים 1. לכן, בנייה מחדש של כבל למבוגרים הפגועים בעמוד השדרה ושיפור במנוע, חושי ותפקוד אוטונומי היא מטרה חשובה של מחקר SCI. תאי גזע עצביים (NSCs), בין אם מבודדים ישירות ממערכת העצבים עובריים או מבוגר, הם תאי מועמד משכנעים להחליף תאי עצב וגליה לאיבוד. יתר על כן, התאים הללו הפוטנציאל להוות ממסרים פונקציונליים חדשים כדי לשחזר הולכה באקסון פני 2,3 אתר נגע. נכון להיום, לא חלה הבהרה מפורטת של אנטומיים, electrophysiological והשפעות ההתנהגותיות של היווצרות ממסר עצבית על ידי NSCs המושתל לאחר SCI החמור. ישנן מספר סיבות לכך: ראשית, NSCs מושתל או רקמת מערכת העצבים המרכזית של העובר לשרוד בצורה גרועה כאשר השתילו לתוך חללי נגע גדולים. מחקרים קודמים הראו אובדן תא המוקדם משמעותי, ומשאיר חללים ריקים נגע גדול פיברוזיס 4,5. בחלק ממחקרי התאים המורכבים היו לאחר מכן להתחלק ולמלא את חלל נגע 4,5, אבל זה עשוי להתרחש באיחור של ימים עד שבועות, ומילוי אתר נגע שלאחר מכן לא יכול להיות שלם או עקבי. שנית, מערכת מעקב יעילה המספקת נתוני קול על הישרדות תאים, התמיינות / התבגרות, ותולדה של NSCs המושתל הייתה חסרה. רוב המחקרים המוקדמים מנוצלים antegrade ותיוג מדרדר לאתר את תחזיות axonal מהשתלות 2,3. עם זאת, טכניקות אלה באופן חלקי בלבד ולעתים קרובות תחזיות שכותרת לא ברור אקסון הנובעות מהתאים מורכבים, ושיטות נותב הן subjecלא לחפצים שנגרמו על ידי דליפה לצבוע מעבר לתאים המושתלים. קבוצות אחרות המשמשות סמנים עצביים ספציפיים אנושיים לתייג תחזיות אקסון לאחר ההשתלה של NSCs העוברי האנושי לחוט השדרה של מכרסמים נפצעו 5,6. עם זאת, במחקרים אלה, xenografts לא שרדה באופן עקבי היטב. לאחרונה, משלוח ויראלית של גן כתב ה-GFP שימש תווית NSCs התרבותי 7,8. עם זאת, הביטוי של GFP היה לעתים קרובות לא עקבי והוא יכול להיות למטה מוסדר 7. לאחרונה, השימוש בעכברים מהונדסים תורם או חולדות ביציבות להביע גן הכתב, ה-GFP, או phosphatase אלקליין השליה האנושי, שיפר באופן משמעותי את המעקב של תאי גזע / אבות עצביים מושתלים in vivo 9,11. שלישית, כמה מחקרים מצביעים על כך NSCs חולדה בתרבית במבחנה הנגזר ממערכת העצבים המרכזית או עובריים או מבוגר לבדל באופן בלעדי לשושלות גליה כאשר מושתלים לתוך המילייה של cor השדרה המבוגר ללא פגע או הפצועד 7,12,13, למרות העובדה שתאי גזע העצביים אלה הם מסוגלים להבדיל לשני תאי עצב וגליה במבחנה, מצביעים על כך שהסביבה מקומית עשויה להכתיב את גורלם של תאי גזע. לחלופין, NSCs התרבותי, במיוחד אלה הנגזרים ממערכת העצבים המרכזית למבוגרים, עשוי להיות נכס מהותי defaulty להתמיין לשושלות גליה in vivo 13. בגלל המגבלות שנדונו לעיל, הקבוצה שלנו לאחרונה פיתחה פרוטוקול חדש כדי לשפר את המעקב עוברי המל&quot;ל, הישרדות, ובידול / התבגרות בחוט השדרה המבוגר נפצע באורח קשה. בקצרה, התחלנו עם קו פישר 344 משפחת מזדווגים עכברים הטרנסגניים יציב להביע גן כתב ה-GFP שמקיים ביטוי של GFP לאחר השתלת in vivo 14. בשלב הבא, אנחנו משמשים NSCs המבודד טרי מיום עוברי 14 344 חוט השדרה פישר, שלב התפתחות ששומר על הפוטנציאל ליצירת שני תאי עצב וגליה. לבסוף, אנו מוטבעיםNSCs טרי ניתק לתוך מטריצת הפיברין המכילה צמיחת גורמי 15-17 כדי לשמר את התאים ובאופן שווה להפיץ אותם בתוך חלל נגע גדול, במטרה לתמוך בהישרדות תא שתל, גזירה ואינטגרציה. שתלי הונחו לתוך אתרים של חיתוך רוחב מלא T3, שבועיים לאחר פגיעה בחוט השדרה. תאים מורכבים אלה מולא באופן עקבי באתרי חיתוך רוחב מלאים ומובחנים לנוירונים בשפע שהשתרעו מספר גדול של אקסונים לחוט השדרה מארח על פני מרחקים ארוכים 18. תוצאות דומות התקבלו באמצעות שתלים של תאי גזע עצביים אנושיים בתרבית לחולדות חיסונית לקוי 18.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Reagents</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue</td>
 <td>Comment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fibrinogen(rat)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>F6755-25MG</td>
 <td>2 hr at 37 &deg;C to dissovle 
 Stock Concentration: 50 mg/ml 
 Final Concentration: 25 mg/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Thrombin (rat)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>T5772-100UN</td>
 <td>Dissovle in 10 mM CaCl2 
 Stock Concentration: 50 U/ml 
 Final Concentration: 25 mg/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>bFGF (human)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>F0291 (25 &mu;g)</td>
 <td>Stock Concentration: 200 ng/&mu;l 
 Final Concentration: 10 ng/&mu;l</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EGF (murine)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>E1257 (0.1 mg)</td>
 <td>Stock Concentration: 200 ng/&mu;l 
 Final Concentration: 10 ng/&mu;l</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BDNF(human)</td>
 <td>Peprotech</td>
 <td>452-02 (1 mg)</td>
 <td>Stock Concentration: 1000 ng/&mu;l 
 Final Concentration: 50 ng/&mu;l</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NT-3 (human)</td>
 <td>Peprotech</td>
 <td>452-03 (1 mg)</td>
 <td>Stock Concentration: 1000 ng/&mu;l 
 Final Concentration: 50 ng/&mu;l</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>GDNF (rat)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>G1401 (10 &mu;g)</td>
 <td>Stock Concentration: 200 ng/&mu;l 
 Final Concentration: 10 ng/&mu;l</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>IGF-1(mouse)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>I8779 (50 &mu;g)</td>
 <td>Stock Concentration: 200 ng/&mu;l 
 Final Concentration: 10 ng/&mu;l</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>aFGF (human)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>F5542 (25 &mu;g)</td>
 <td>Stock Concentration: 200 ng/&mu;l 
 Final Concentration: 10 ng/&mu;l </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PDGF-AA (human)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>P3076 (10 &mu;g)</td>
 <td>Stock Concentration: 200 ng/&mu;l 
 Final Concentration: 10 ng/&mu;l</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HGF (human)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>H9661 (5 &mu;g)</td>
 <td>Stock Concentration: 200 ng/&mu;l 
 Final Concentration: 10 ng/&mu;l</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MDL28170</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>M6690 (25 mg)</td>
 <td>Stock in DMSO 
 Stock Concentration: 1 mM 
 Final Concentration: 50 &mu;M</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PBS</td>
 <td>Millipore</td>
 <td>BSS-1005-B</td>
 <td>Stock Concentration: 1X 
 Final Concentration: 1X</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DMSO</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>D2650</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ketamine</td>
 <td>Putney</td>
 <td>26637-411-01</td>
 <td>40-80 mg/kg 
 Stock Concentration: 100 mg/ml 
 Final Concentration: 25 mg/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Xylazine</td>
 <td>Lloyd</td>
 <td>0410,</td>
 <td>2.5-8 mg/ml 
 Stock Concentration: 100 mg/ml 
 Final Concentration: 1.3 mg/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Acepromazine</td>
 <td>Butler</td>
 <td>003845</td>
 <td>0.5-4 mg/ml 
 Stock Concentration: 10 mg/ml 
 Final Concentration: 0.25 mg/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Betadine</td>
 <td>Healthpets</td>
 <td>BET16OZ</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ringers</td>
 <td>Abbott</td>
 <td>04860-04-10</td>
 <td>2-3 ml/inj</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Banamine</td>
 <td>Schering-Plough</td>
 <td>0061-0851-03</td>
 <td>2.5 -5 mg/kg 
 Stock Concentration: 50 mg/ml 
 Final Concentration: 0.5 mg/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ampicillin</td>
 <td>Sandoz</td>
 <td>0781-3404-85</td>
 <td>80-100 mg/kg 
 Final Concentration: 50 mg/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>LH-RH</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>L4513</td>
 <td>200 &mu;g/kg 
 Final Concentration: 200 &mu;g/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HBSS</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>14175-096</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Trypsin</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>25200056 </td>
 <td>Stock Concentration: 0.25 % 
 Final Concentration: 0.125 %</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DMEM</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>11995073 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>FBS</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>16000044 </td>
 <td>Stock Concentration: 100 % 
 Final Concentration: 10 %</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Neurobasal Medium</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>21103049 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>B27</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>17504044</td>
 <td>Stock Concentration: 100x 
 Final Concentration: 1x</td>
 </tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Note, use human reagents for grafts of human NSCs</td>
 </tbody>
</table>

promotion of survival and differentiation of neural stem cells with fibrin and growth factor cocktails after severe spinal cord injury

תאי גזע עצביים (NSCs) יכולים עצמי לחדש ולהתמיין לתאי עצב וגליה. NSCs המושתל יכול להחליף את תאי עצב וגליה אבודים לאחר פגיעה בחוט השדרה (SCI), ויכול להיווצר ממסרים פונקציונליים להתחבר מחדש מקטעי חוט השדרה מעל ומתחת לנגע. מחקרים קודמים השתלת תאי גזע עצביים היו מוגבלים על ידי הישרדות שתל שלמה בתוך חלל נגע חוט השדרה. יתר על כן, מעקב של הישרדות תא שתל, בידול, והארכת תהליך לא היה אופטימלי. לבסוף, במחקרים קודמים, NSCs חולדה בתרבית דווחו בדרך כלל להתמיין לגליה כאשר השתיל לחוט השדרה נפגע, ולא נוירונים, אלא אם הגורל היה מונע לסוג תא מסוים. כדי לטפל בבעיות אלה, פיתחנו שיטות חדשות לשיפור ההישרדות, האינטגרציה והבחנה של NSCs לאתרים של SCI אפילו חמור. NSCs בודדו טרי מכבל עוברי יום 14 השדרה (E14) מקו יציב מהונדס פישר 344 חולדה להביע fl הירוקחלבון uorescent (GFP) והיו משובצים למטריצת הפיברין המכילה גורמי גדילה; ניסוח זה נועד כדי לשמור על תאים מורכבים בחלל הנגע ולתמוך בהישרדות תא. NSCs בקוקטייל הפיברין / גורם הגדילה הושתלו שבועיים לאחר transections השדרה החזי מלא ברמת 3 (T3) כבל, וכך להימנע מתקופות שיא של דלקת. שתלים וכתוצאה מכך מלאים לחלוטין חלל הנגע ומובחן לשני נוירונים, שהשתרעו אקסונים אל חוט השדרה המארח על פני מרחקים ארוכים להפליא, וגליה. שתלי של NSCs אדם המתורבת להביע GFP הביאו לממצאים דומים. לכן, שיטות מוגדרות לשיפור השתלת תאי גזע עצבי, הישרדות וניתוח של ממצאי in vivo.

תיוג immunohistological GFP מוכיח כי NSCs חולדה מורכב resuspended בופר פוספט (PBS) (חסר מטריצת הפיברין וגורמי גדילה) שרד בצורה גרועה באתר חיתוך רוחב T3, רק הצמדת לשוליים נגע / המארח ועוזבים את רוב אתר הנגע ריק ללא תאים מורכבים (איור 2 א). ההישרדות של NSCs משופר בעת שיתוף מורכב עם מטריצ?...

Watch this Scientific Journal Video about Promotion of Survival and Differentiation of Neural Stem Cells with Fibrin and Growth Factor Cocktails after Severe Spinal Cord Injury at JoVE.com

Promotion of Survival and Differentiation of Neural Stem Cells with Fibrin and Growth Factor Cocktails after Severe Spinal Cord Injury

מטריצות הפיברין המכילות גורמי גדילה שימשו כדי לשמר את תאי גזע עצביים מורכבים לתוך אתרים של חיתוך רוחב חוט השדרה. תאים מורכבים מלאים לחלוטין חלל הנגע ומובחן לסוגים שונים עצבי תאים, כוללים תאי עצב שהשתרעו אקסונים לחוט השדרה מארח על פני מרחקים ארוכים.

קידום ההישרדות וההתמיינות של תאי גזע עצביים עם פיברין וקוקטיילי גורם גדילה לאחר פגיעה בחוט השדרה חמורה

Neural stem cells (NSCs) can self-renew and differentiate into neurons and glia. Transplanted NSCs can replace lost neurons and glia after spinal cord ...

promotion-survival-differentiation-neural-stem-cells-with-fibrin

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.3K Views.  Veterans Administration Medical Center, San Diego.  מטריצות הפיברין המכילות גורמי גדילה שימשו כדי לשמר את תאי גזע עצביים מורכבים לתוך אתרים של חיתוך רוחב חוט השדרה. תאים מורכבים מלאים לחלוטין חלל הנגע ומובחן לסוגים שונים עצבי תאים, כוללים תאי עצב שהשתרעו אקסונים לחוט השדרה מארח על פני מרחקי...

Video: Promotion of Survival and Differentiation of Neural Stem Cells with Fibrin and Growth Factor Cocktails after Severe Spinal Cord Injury

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

Dissection והתרבות של נוירונים Commissural מחוט השדרה עובריים

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Growth and Differentiation of Adult Hippocampal Arctic Ground Squirrel Neural Stem Cells

Arctic ground squirrels (Urocitellus parryii, AGS) are unique in their ability to hibernate with a core body temperature near or below freezing 1. These animals also resist ischemic injury to the brain in vivo 2,3 and oxygen-glucose deprivation in vitro 4,5. These unique qualities provided the impetus to isolate AGS neurons to examine inherent neuronal characteristics that could account for the capacity of AGS neurons to resist injury and cell death caused by ischemia and extremely cold temperatures. Identifying proteins or gene targets that allow for the distinctive properties of these cells could aid in the discovery of effective therapies for a number of ischemic indications and for the study of cold tolerance. Adult AGS hippocampus contains neural stem cells that continue to proliferate, allowing for easy expansion of these stem cells in culture. We describe here methods by which researchers can utilize these stem cells and differentiated neurons for any number of purposes. By closely following these steps the AGS neural stem cells can be expanded through two passages or more and then differentiated to a culture high in TUJ1-positive neurons (~50%) without utilizing toxic chemicals to minimize the number of dividing cells. Ischemia induces neurogenesis 6 and neurogenesis which proceeds via MEK/ERK and PI3K/Akt survival signaling pathways contributes to ischemia resistance in vivo7 and in vitro 8 (Kelleher-Anderson, Drew et al., in preparation). Further characterization of these unique neural cells can advance on many fronts, using some or all of these methods.

Neural stem cells were prepared from the hippocampus of adult non-hibernating yearling Arctic ground squirrels (AGS). These neural stem cells can be expanded through numerous passages, differentiated and maintained as a nearly 50:50 neuron to glial culture.

גדילה והתמיינות של מבוגרים בהיפוקמפוס סנאי הארקטי קרקע תאים גזע עצביים

Arctic ground squirrels (Urocitellus parryii, AGS) are unique in their ability to hibernate with a core body temperature near or below freezing 1. These ...

Surgical Transplantation of Mouse Neural Stem Cells into the Spinal Cords of Mice Infected with Neurotropic Mouse Hepatitis Virus

Mice infected with the neurotropic JHM strain of mouse hepatitis virus (MHV) develop pathological and clinical outcomes similar to patients with the demyelinating disease Multiple Sclerosis (MS). We have shown that transplantation of NSCs into the spinal cords of sick mice results in a significant improvement in both remyelination and in clinical outcome. Cell replacement therapies for the treatment of chronic neurologic diseases are now a reality and in vivo models are vital in understanding the interactions between the engrafted cells and host tissue microenvironment. This presentation provides an adapted method for transplanting cells into the spinal cord of JHMV-infected mice. In brief, we provide a procedure for i) preparation of NSCs prior to transplant, ii) pre-operative care of mice, iii) exposure of the spinal cord via laminectomy, iv) stereotactic injection of NSCs, and iv) post-operative care.

The transplantation of mouse neural stem cells (NSCs) into the spinal cords of mice with established demyelination is detailed. The preparation of NSCs, the laminectomy of thoracic vertebra 9 (T9), and transplantation of NSCs is outlined along with the pre- and post-operative care of the mice.

כירורגי של השתלת תאים עכבר גזע עצביים לתוך מיתרי השדרה של עכברים נגועים בנגיף הפטיטיס עכבר Neurotropic

Mice infected with the neurotropic JHM strain of mouse hepatitis virus (MHV) develop pathological and clinical outcomes similar to patients with the ...

Lateral Fluid Percussion: Model of Traumatic Brain Injury in Mice

Traumatic brain injury (TBI) research has attained renewed momentum due to the increasing awareness of head injuries, which result in morbidity and mortality. Based on the nature of primary injury following TBI, complex and heterogeneous secondary consequences result, which are followed by regenerative processes 1,2. Primary injury can be induced by a direct contusion to the brain from skull fracture or from shearing and stretching of tissue causing displacement of brain due to movement 3,4. The resulting hematomas and lacerations cause a vascular response 3,5, and the morphological and functional damage of the white matter leads to diffuse axonal injury 6-8. Additional secondary changes commonly seen in the brain are edema and increased intracranial pressure 9. Following TBI there are microscopic alterations in biochemical and physiological pathways involving the release of excitotoxic neurotransmitters, immune mediators and oxygen radicals 10-12, which ultimately result in long-term neurological disabilities 13,14. Thus choosing appropriate animal models of TBI that present similar cellular and molecular events in human and rodent TBI is critical for studying the mechanisms underlying injury and repair.
Various experimental models of TBI have been developed to reproduce aspects of TBI observed in humans, among them three specific models are widely adapted for rodents: fluid percussion, cortical impact and weight drop/impact acceleration 1. The fluid percussion device produces an injury through a craniectomy by applying a brief fluid pressure pulse on to the intact dura. The pulse is created by a pendulum striking the piston of a reservoir of fluid. The percussion produces brief displacement and deformation of neural tissue 1,15. Conversely, cortical impact injury delivers mechanical energy to the intact dura via a rigid impactor under pneumatic pressure 16,17. The weight drop/impact model is characterized by the fall of a rod with a specific mass on the closed skull 18. Among the TBI models, LFP is the most established and commonly used model to evaluate mixed focal and diffuse brain injury 19. It is reproducible and is standardized to allow for the manipulation of injury parameters. LFP recapitulates injuries observed in humans, thus rendering it clinically relevant, and allows for exploration of novel therapeutics for clinical translation 20.
We describe the detailed protocol to perform LFP procedure in mice. The injury inflicted is mild to moderate, with brain regions such as cortex, hippocampus and corpus callosum being most vulnerable. Hippocampal and motor learning tasks are explored following LFP.

Lateral fluid percussion (LFP), an established model of traumatic brain injury in mice, is demonstrated. LFP fulfills three major criteria for animal models: validity, reliability and clinical relevance. The procedure, consisting of surgical craniotomy, fixation of hub followed by induction of injury, resulting in focal and diffuse injuries, is described.

נוזל הקשה Lateral: דגם של פגיעה מוחית טראומטית של עכברים

Traumatic brain injury (TBI) research has attained renewed momentum due to the increasing awareness of head injuries, which result in morbidity and ...

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several weeks, and this is accompanied by short distance regeneration (a few mm) of propriospinal axons and spinal-projecting axons from the brainstem. Among the 36 large identifiable spinal-projecting neurons, some are good regenerators and others are bad regenerators. These neurons can most easily be identified in wholemount CNS preparations. In order to understand the neuron-intrinsic mechanisms that favor or inhibit axon regeneration after injury in the vertebrates CNS, we determine differences in gene expression between the good and bad regenerators, and how expression is influenced by spinal cord transection. This paper illustrates the techniques for housing larval and recently transformed adult sea lampreys in fresh water tanks, producing complete spinal cord transections under microscopic vision, and preparing brain and spinal cord wholemounts for in situ hybridization. Briefly, animals are kept at 16&#160;&#176;C and anesthetized in 1% Benzocaine in lamprey Ringer. The spinal cord is transected with iridectomy scissors via a dorsal approach and the animal is allowed to recover in fresh water tanks at 23 &#176;C. For in situ hybridization, animals are reanesthetized and the brain and cord removed via a dorsal approach.

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

Lampreys recover locomotion after a complete spinal cord injury. However, some spinal-projecting neurons are good regenerators and others are not. This paper illustrates the techniques for housing sea lamprey larvae (and recently transformed adults), producing complete spinal cord transections and preparing wholemount brains and spinal cords for in situ hybridization.

חוט השדרה מלא פגיעה ומוח Dissection פרוטוקול Wholemount לאחר<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה בזחל ים צמד ים

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several ...

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal degeneration. Lack of growth cone formation, regeneration, and loss of additional myelinated axonal projections within the spinal cord greatly limits neurological recovery following injury. To assess how central myelinated axons of the spinal cord respond to injury, we developed an ex vivo living spinal cord model utilizing transgenic mice that express yellow fluorescent protein in axons and a focal and highly reproducible laser-induced spinal cord injury to document the fate of axons and myelin (lipophilic fluorescent dye Nile Red) over time using two-photon excitation time-lapse microscopy. Dynamic processes such as acute axonal injury, axonal retraction, and myelin degeneration are best studied in real-time. However, the non-focal nature of contusion-based injuries and movement artifacts encountered during in vivo spinal cord imaging make differentiating primary and secondary axonal injury responses using high resolution microscopy challenging. The ex vivo spinal cord model described here mimics several aspects of clinically relevant contusion/compression-induced axonal pathologies including axonal swelling, spheroid formation, axonal transection, and peri-axonal swelling providing a useful model to study these dynamic processes in real-time. Major advantages of this model are excellent spatiotemporal resolution that allows differentiation between the primary insult that directly injures axons and secondary injury mechanisms; controlled infusion of reagents directly to the perfusate bathing the cord; precise alterations of the environmental milieu (e.g., calcium, sodium ions, known contributors to axonal injury, but near impossible to manipulate in vivo); and murine models also offer an advantage as they provide an opportunity to visualize and manipulate genetically identified cell populations and subcellular structures. Here, we describe how to isolate and image the living spinal cord from mice to capture dynamics of acute axonal injury.

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability.

<em&gt; Ex Vivo</em&gt; חוט השדרה מושרה לייזר הפגיעה דגם להערכת מנגנוני axonal הניוון בזמן אמת

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

הדמיה פעילות עצבית בתוך קליפת המגע הראשי באמצעות Thy1-העכברים הטרנסגניים GCaMP6s

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

A Neurosphere Assay to Evaluate Endogenous Neural Stem Cell Activation in a Mouse Model of Minimal Spinal Cord Injury

Neural stem cells (NSCs) in the adult mammalian spinal cord are a relatively mitotically quiescent population of periventricular cells that can be studied in vitro using the neurosphere assay. This colony-forming assay is a powerful tool to study the response of NSCs to exogenous factors in a dish; however, this can also be used to study the effect of in vivo manipulations with the proper understanding of the strengths and limitations of the assay. One manipulation of the clinical interest is the effect of injury on endogenous NSC activation. Current models of spinal cord injury provide a challenge to study this as the severity of common contusion, compression, and transection models cause the destruction of the NSC niche at the site of the injury where the stem cells reside. Here, we describe a minimal injury model that causes localized damage at the superficial dorsolateral surface of the lower thoracic level (T7/8) of the adult mouse spinal cord. This injury model spares the central canal at the level of injury and permits analysis of the NSCs that reside at the level of the lesion at various time points following injury. Here, we show how the neurosphere assay can be utilized to study the activation of the two distinct, lineally-related, populations of NSCs that reside in the spinal cord periventricular region - primitive and definitive NSCs (pNSCs and dNSCs, respectively). We demonstrate how to isolate and culture these NSCs from the periventricular region at the level of injury and the white matter injury site. Our post-surgical spinal cord dissections show increased numbers of pNSC and dNSC-derived neurospheres from the periventricular region of injured cords compared to controls, speaking to their activation via injury. Furthermore, following injury, dNSC-derived neurospheres can be isolated from the injury site &#8212; demonstrating the ability of NSCs to migrate from their periventricular niche to sites of injury.

Here, we demonstrate the performance of a minimal spinal cord injury model in an adult mouse that spares the central canal niche housing endogenous neural stem cells (NSCs). We show how the neurosphere assay can be used to quantify activation and migration of definitive and primitive NSCs following injury.

Neurosphere Assay כדי להעריך את הפעלת אנדוגני תאי גזע עצביים במודל של עכברים של פגיעה בחוט השדרה מינימלי

Neural stem cells (NSCs) in the adult mammalian spinal cord are a relatively mitotically quiescent population of periventricular cells that can be studied ...

Identifying Cell Surface Markers of Primary Neural Stem and Progenitor Cells by Metabolic Labeling of Sialoglycan

Neural stem and progenitor cells (NSPCs) are the cellular basis for the complex structures and functions of the brain. They are located in specialized niches in vivo and can be isolated and expanded in vitro, serving as an important resource for cell transplantation to repair brain damage. However, NSPCs are heterogeneous and not clearly defined at the molecular level or purified due to a lack of specific cell surface markers. The protocol presented, which has been previously reported, combines a neural-endothelial co-culture system with a metabolic glycan labeling method to identify the surface sialoglycoproteome of primary NSPCs. The NSPC-endothelial co-culture system allows self-renewal and expansion of primary NSPCs in vitro, generating a sufficient number of NSPCs. Sialoglycans in cultured NSPCs are labeled using an unnatural sialic acid metabolic reporter with bioorthogonal functional groups. By comparing the sialoglycoproteome from self-renewing NSPCs expanded in an endothelial co-culture with differentiating neural culture, we identify a list of membrane proteins that are enriched in NSPCs. In detail, the protocol involves: 1) set-up of an NSPC-endothelial co-culture and NSPC differentiating culture; 2) labeling with azidosugar per-O-acetylated N-azidoacetylmannosamine (Ac4ManNAz); and 3) biotin conjugation to modified sialoglycan for imaging after fixation of neural culture or protein extraction from neural culture for mass spectrometry analysis. Then, the NSPC-enriched surface marker candidates are selected by comparative analysis of mass spectrometry data from both the expanded NSPC and differentiated neural cultures. This protocol is highly sensitive for identifying membrane proteins of low abundance in the starting materials, and it can be applied to marker discovery in other systems with appropriate modifications

Presented here is a protocol that combines an in vitro neural-endothelial co-culture system and metabolic incorporation of sialoglycan with bioorthogonal functional groups to expand primary neural stem and progenitor cells and label their surface sialoglycoproteins for imaging or mass-spectrometry analysis of cell surface markers.

זיהוי סמני שטח תא של גזע עצבי ראשוני ובתאי מחולל מטבולית על ידי תיוג מטבולי של סילוגליקן

Neural stem and progenitor cells (NSPCs) are the cellular basis for the complex structures and functions of the brain. They are located in specialized ...

Activity-based Training on a Treadmill with Spinal Cord Injured Wistar Rats

Spinal cord injury (SCI) results in lasting deficits that include both mobility and a multitude of autonomic-related dysfunctions. Locomotor training (LT) on a treadmill is widely used as a rehabilitation tool in the SCI population with many benefits and improvements to daily life. We utilize this method of activity-based task-specific training (ABT) in rodents after SCI to both elucidate the mechanisms behind such improvements and to enhance and improve upon existing clinical rehabilitation protocols. Our current goal is to determine the mechanisms underlying ABT-induced improvements in urinary, bowel, and sexual function in SCI rats after a moderate to severe level of contusion. After securing each individual animal in a custom-made adjustable vest, they are secured to a versatile body weight support mechanism, lowered to a modified three-lane treadmill and assisted in step-training for 58 minutes, once a day for 10 weeks. This setup allows for the training of both quadrupedal and forelimb-only animals, alongside two different non-trained groups. Quadrupedal-trained animals with body weight support are aided by a technician present to assist in stepping with proper hind limb placement as necessary, while forelimb-only trained animals are raised at the caudal end to ensure no hind limb contact with the treadmill and no weight-bearing. One non-trained SCI group of animals is placed in a harness and rests next to the treadmill, while the other control SCI group remains in its home cage in the training room nearby. This paradigm allows for the training of multiple SCI animals at once, thus making it more time-efficient in addition to ensuring that our pre-clinical animal model mimics the clinical representation as close as possible, particularly with respect to the body weight support with manual assistance.

This protocol demonstrates our model of activity-based locomotor treadmill training for rats with spinal cord injury (SCI). Included is both quadrupedal and forelimb-only groups, in addition to two distinct types of non-trained control groups. Investigators are able to assess training effects on SCI rats using this protocol.

ההדרכה מבוססי פעילות על הליכון עם חוט השדרה נפגע Wistar חולדות

Spinal cord injury (SCI) results in lasting deficits that include both mobility and a multitude of autonomic-related dysfunctions. Locomotor training (LT) ...