资金从欧洲研究委员会收到了欧盟第七框架计划（FP7/2007-2013）下/ ERC赠款协定没有[239603]

<ol><li>步骤2（2.1-2.6），如果一个手套箱不可用，跳到另一种;准备的V（V）配合物（ 图2）; 18行为步骤1.1-1.4的手套箱。 <ol><li>溶解0.42的配位体的毫摩尔的 H 2升的无水THF中，并将其添加到VO的等效量的（O I镨）在THF中的搅拌溶液3。 </li><li>在室温下15分钟搅拌反应混合物，并除去真空下挥发物。 </li><li>加冷正己烷并在真空下将其删除。暗紫色粉末应以定量收率得到。 </li><li>称量得到的化合物的8毫克在Eppendorf管中。跳到第3步。 </li></ol></li><li>使用的Schlenk线制备V（V）络合物。 <ol><li>溶解0.42毫摩尔的配位体H 2升的无水THF中，在干燥的Schlenk烧瓶中，带隔片盖，连接到在Schlenk线，并应用交替真空/惰性气体（N 2或Ar）的环境中，它建议申请3篇UCH轮，等待2-5分钟的真空阶段。 </li><li>用注射器通过隔膜帽加入干燥的THF。 </li><li>加入VO（O I Pr）的同等金额的THF溶液，已被同样准备通过挂钩适当干燥的Schlenk烧瓶中的行，应用惰性环境，并通过从钒解决了的注射器加入试剂3配体。 </li><li>在室温下15分钟搅拌反应混合物，并除去真空下挥发，如果有不稳定的产品的一个问题，进行惰性气氛下挥发的Schlenk型蒸馏;使用惰性气体流，以连接已被预干燥所需的玻璃器皿。 </li><li>加冷正己烷并在真空下将其删除。暗紫色粉末应以定量收率得到。 </li><li>称量得到的化合物的8毫克在Eppendorf管中。 </li></ol></li><li> （Ⅳ）配合物（ 图2）的制备Ti; 28 </s高达&gt;行为的步骤在手套箱3.1-3.3，如果一个手套箱不适，调整为模拟钒（步骤2）雇用的Schlenk行，而不是讨论的替代措施。 <ol><li>溶解0.35的配位体H 2升的无水THF毫摩尔并将其添加到钛（O I Pr）的4在THF中的等量的搅拌溶液中。 </li><li>在室温下2小时搅拌反应混合物。除去真空下挥发物，得到定量产率为黄色产物。 </li><li>称量得到的在Eppendorf小瓶化合物8毫克。 </li></ol></li><li> HT-29细胞的96孔板的下游<ol><li>培养HT-29细胞在75cm 2的烧瓶中，用RPMI-1640培养基中含有1％青霉素/链霉素抗生素，1％L-谷氨酰胺和10％胎牛血清（FBS），在37℃，5％CO 2的。 </li><li>取出介质时，HT-29细胞达到最大汇合（90-100％，每3-4天传代培养无）。用1毫升洗涤胰蛋白酶（0.25％）/ EDTA（0.05％）溶液，并删除它。 </li><li>加入1 ml的胰蛋白酶（0.25％）/ EDTA（0.05％）溶液孵育5分钟。 </li><li>从烧瓶中分离对HT-29细胞加入10毫升培养基中的禁用胰蛋白酶活性。转移5毫升细胞混合物与管。 </li><li>用吸管滴几滴细胞混合物转移到计数器室。计数器室包括5×5格。 </li><li>的4平方在角部和一个在中间：用显微镜计数细胞在5代表正方形。 </li><li>计算细胞目前的估计金额。总结了细胞在5代表正方形和除以20。 </li><li>通过4.7步的结果除以0.6。所接收到的数字是每板所需的细胞混合物的量。该计算是指含有0.6×10 6细胞（每孔9000个细胞）的板。 </li><li>用移液管转移市盈率市所需细胞混合物的量晚期（如计算第4.8节），并添加13.2毫升培养基（每孔×66孔200微升）。 </li><li>由11通道移液器（每孔200微升，6行，66孔总数）的混合物加至96孔板中。每行一个好应为空白对照保持为空。 </li><li>将培养板在37℃，5％CO 2中放置24小时，使细胞附着到板上。 </li></ol></li><li>化合物的插入<ol><li> （根据所期望的浓度范围内，或不同量）的无水THF到各化合物的8毫克加入200μl称量如在步骤1.4（或2.6）或3.3所述。权衡的配位体的 H 2 L 8毫克，也是。 </li><li>在9种不同的Eppendorf小瓶中加入60微升四氢呋喃进一步稀释每个化合物溶液。 </li><li>用移液管加入60μl由5.1节中的混合物在第一的Eppendorf小瓶中，重悬并转移60微升至下一个小瓶中，依此类推，直到传输10个不同的浓度分别为邻btained（包括第5.1父混合物）。 </li><li>稀释20微升各种浓度的THF与180微升培养基。 </li><li>准备一个控制解决方案，用THF仅20微升的THF用180微升培养基中的每个测量。 </li><li>加10微升从所得的溶液（包括十二烷基硫酸钠控制），对每一个已含有200μl的细胞的上述溶液在培养基中以使最终浓度高达200毫克/升的化合物（浓度范围内能很好地根据该化合物的活性）来改变。 </li><li>您可能会发现一些沉淀在根据化合物的溶解度应用的最高浓度。 </li><li>重复该化合物3倍（在相同的化合物的板3行）的各测定，每行包含：用在10个不同的浓度，以及不含有细胞为空白仅用于控制和1与溶剂处理1以及含有细胞的化合物处理过的细胞控制。 </li><li>孵育加载板3天，在37℃下在5％CO 2气氛中。 </li></ol></li><li>采用MTT法测定细胞毒作用<ol><li>通过加入1g MTT粉末到200ml溶液的RPMI-1640培养基中的无酚红制备的MTT溶液。原液可以划分到15ml试管，并存储在-20℃。 </li><li>加入20μl的MTT溶液到每个使用以及11道移液器（除空白对照孔不从步骤4.10的细胞），并孵育板额外的3小时。 </li><li>除去各孔的培养基溶液。 </li><li>添加200μl的异丙醇以每孔以溶解甲。搅动板0.5小时，直到均匀性达到。 </li><li>测量的吸光度在550nm处为200微升通过微量板读数器分光光度计在上述溶液中。 </li><li>各重复测量（包括3次重复，见步骤5.8）在3个不同的日子。 </li><li>计算吨细胞生存力通过从测量值减去空白对照的吸光度值，将结果除以在THF溶剂中的控制值的吸光度，并乘以100％，他的百分比。 </li><li>使用GraphPad Prism软件（或同等学历）计算IC 50值。 </li><li>所报告的IC 50是收集在至少三个不同天所有的IC 50值的平均值，误差值的标准偏差。 </li></ol></li></ol>

<ol>
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Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxicity+and+Hydrolysis+of+trans-Ti(IV)+Complexes+of+Salen+Ligands:+Structure-Activity+Relationship+Studies.">Cytotoxicity and Hydrolysis of trans-Ti(IV) Complexes of Salen Ligands: Structure-Activity Relationship Studies.</a> Inorganic Chemistry. 51, 1796-1804 (2012).</li><li>Tshuva, E. Y., Peri, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modern+cytotoxic+titanium(IV)+complexes;+Insights+on+the+enigmatic+involvement+of+hydrolysis.">Modern cytotoxic titanium(IV) complexes; Insights on the enigmatic involvement of hydrolysis.</a> Coordination Chemistry Reviews. 253, 2098-2115 (2009).</li><li>Shavit, M., Peri, D., Manna, C. M., Alexander, J. S., Tshuva, E. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Group+4+complexes+with+aminebisphenolate+ligands+and+their+application+for+the+ring+opening+polymerization+of+cyclic+esters.">Group 4 complexes with aminebisphenolate ligands and their application for the ring opening polymerization of cyclic esters.</a> Macromolecules. 39, 7250-7257 (2006).</li><li>Sebaugh, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+accurate+EC50/IC50+estimation.">Guidelines for accurate EC50/IC50 estimation.</a> Pharmaceutical Statistics. 10, 128-134 (2011).</li><li>Yung, W. K. 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作者宣称他们没有竞争的经济利益。

在这个手稿中描述的方法结合化学合成与生物细胞活力检测。与关于活细胞的任何生物的方法，这是至关重要的，在层流罩的工作，并保持在无菌条件，包括使用无菌有机溶剂。另外，制备的水解不稳定的金属为基础的药物，并存储应进行惰性条件下，对​​其中的手套箱或舒伦克线技术应该被利用。 该技术的选择惰性的环境下工作，主要是依赖于手套箱的可用性。如果有?...

化疗仍然是在临床上用于各种癌症疾病的治疗采用的主要课程之一，并由此研究大量的，目的是开发新的和改进的抗癌药物世界范围内进行。这样的研究大多开始在化学级，与化合物的设计和制备，接着在体外的细胞毒性生物学评价。细胞活力可以通过各种检测，提供对细胞活性1-2的信息进行评估。 顺铂是铂络合物被广泛用作化学治疗药物，它被认为是一种有效的治疗主要针对睾丸癌和卵巢癌3-4的例子。然而，其狭窄的活动范围和严重的副作用引发的其他烈性过渡金属配合物5-8的研究。其中，钛（IV）和钒（V）配合物表现出较高的活性的有希望的结果，并减少毒性9-16。钛（Ⅳ）络合物是第一顺铂后，由于这些特性，进入临床试验，但是，他们并没有审判，由于配方的困难和水解稳定性。因此，有电流需要开发对这些金属配合物可结合高抗癌活性与耐水性15,17-21改进的衍生物。 中的Ti（IV）和V的制备方法的一个挑战（V）配合物是指将前体试剂的水解不稳定性，因此，在惰性气氛应保持。钛（Ⅳ）和V（Ⅴ）化合物的制备方法为N 2或Ar条件下，在手套箱中，或使用的Schlenk线技术下进行。 用于抗癌活性的评价的一个常见方法是基于MTT（3 - （4,5 - dimethylthiazolyl）-2,5 - 二苯基溴化）测定。此法是由Mosmann的提出在1983年比色可行性分析22。它是非常充分的研究和表征，并评估新细胞毒性化合物的效力时，由于其精确度，快速性，及对多种细胞系被应用能力它被认为是高效的。此活力测定是基于当它暴露于活细胞的MTT分子的颜色变化。的吸光度，这是成正比的存活细胞的数量，并且相比于未处理的对照的测定中，使所测试的化合物的细胞生长抑制的能力的评估。 的MTT比色分析法在96孔板形式23进行。该细胞可能需要预培养在添加了测试药物的前孔中。在预温育时间可以从0-24小时，根据细胞系的属性而变化。细胞通常暴露于药物为24-96小时，这取决于药物的活性。 MTT溶液然后被加入到经处理的细胞，其中所述叫喊超重MTT是由多种线粒体和细胞质酶，操作中存活的细胞（ 图1）24减少到紫色的甲（formazan）。将MTT分子不是由死细胞或红细胞（代谢不活跃的细胞），脾细胞（静息细胞）和伴刀豆球蛋白A刺激淋巴细胞（活化细胞）22减小。经过3-4小时培养用MTT甲臜沉淀。甲臜形成0.5小时培养后开始，但为获得最佳结果，最好是将细胞暴露于MTT至少3小时22。因此，在生长介质中被删除，甲溶解在有机溶剂中，优选异丙醇25，虽然DMSO也可以使用26。消除了介质是因为酚红，这是广泛通用于生长培养基中获得准确的结果，并且沉淀的蛋白质可与吸光度测定25干涉的关键。当经残溶液达到均匀，该溶液的吸光度用酶标仪分光光度计测定。在550nm处的吸光度是成正比的细胞以每孔细胞200-50,000的范围内的数目，并且因此可以检测到非常少量的细胞22。的吸光度表示存活细胞是保持与药物治疗后的金额，并进行比较了未暴露于药物的对照细胞的吸光度。通过适当的软件分析的结果提供了IC 50值（抑制浓度50％）的值及其统计误差的基础上，测定重复几次。 MTT分析是广泛通用的细胞毒性研究中用于筛选新的抗癌化合物，由于它的精度和相对简单。然而，使用MTT测定法，它依赖于酶促反应时，必须考虑各种酶抑制剂可以影响一个MTT的还原ð导致错误的结果27。此外，本MTT实验不提供对药物2的细胞毒性活性的分子机理的任何信息。

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagent/Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>04-007-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexane AR</td>
			<td>Gadot</td>
			<td>830122313</td>
			<td>Dried using a solvent drying system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT-29 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol AR</td>
			<td>Gadot</td>
			<td>830111370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>03-020-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5655-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin antibiotics</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>03-031-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 with phenol red with L-glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI without phenol red</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>01-103-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrahydrofuran (THF) AR</td>
			<td>Gadot</td>
			<td>830156391</td>
			<td>dried using a solvent drying system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti(OiPr)4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>205273-500ML</td>
			<td>moisture sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>03-052-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VO(OiPr)3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>404926-10G</td>
			<td>moisture sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-channel pipette 30-300 &#956;l</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-channel pipette 5-50 &#956;l</td>
			<td>Finnpipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 cm2 flask</td>
			<td>NUNC</td>
			<td>156472</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate with lid (flat bottom)</td>
			<td>NUNC</td>
			<td>167008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Binder</td>
			<td>APT.line C150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counter chamber</td>
			<td>Marienfeld-Superior</td>
			<td>650030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf vial</td>
			<td>KARTELL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glove box</td>
			<td>M. Braun</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td>ADS LAMINAIRE</td>
			<td>OPTIMALE 12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader spectrophotometer</td>
			<td>Bio-Tek</td>
			<td>El-800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse TS100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 20-200 &#956;l</td>
			<td>Finnpipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 5-50 &#956;l</td>
			<td>Finnpipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

anticancer metal complexes: synthesis and cytotoxicity evaluation by the mtt assay

钛（IV）和钒（V）的配合物是高度有效的抗癌剂。在它们的合成方法的一个挑战是指它们的水解不稳定性，所以它们的制备方法，应在惰性气氛下进行。评价这些复合物的抗癌活性可通过MTT法来实现。 MTT测定是基于酶催还原的MTT分子为甲，当它暴露于活细胞的比色测定法的可行性。减少的结果是在MTT分子的颜色变化。吸光度测量值相对于对照测定下列其与不同浓度的试验化合物，它被转换为所述化合物的抗癌活性，其IC 50值的处理剩余的存活癌细胞的百分比。 MTT法是广泛普遍的，由于其精确性，快速性，和相对简单的细胞毒性研究。 在此，我们预发送一个详细的协议，用于合成气敏感金属类药物和细胞活力的测量，包括制备的细胞板的，该化合物与细胞温育后，使用MTT测定法，并测定IC 50值的可行性测量。

根据既定程序18,28，它们的纯度可以用NMR和元素分析来评估制备的复合物。 从MTT测定接收到的数据进行分析，以评估化合物18,21的细胞毒性。首先，执行从所有其他值减法空白对照吸光度值。第二，在THF溶剂中的控制值被设置为100％生存力，因为没有生长抑制化合物的溶液。根据控制所有其它值被变换成活力的百分比。的浓度应用和计算出的相对存活率百分比...

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Anticancer Metal Complexes: Synthesis and Cytotoxicity Evaluation by the MTT Assay

一种用于合成气敏感的钛和钒的抗癌剂的方法进行说明，随着朝向通过MTT测定人肿瘤细胞系的细胞毒活性进行评价。

抗癌金属配合物的合成与细胞毒性评价MTT法

Titanium (IV) and vanadium (V) complexes are highly potent anticancer agents. A challenge in their synthesis refers to their hydrolytic instability; ...

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