作者想感谢格伦·斯洛克姆（威斯康星医学院）和科琳A.拉文（尼康仪器公司）与显微镜实验优秀的技术援助。这项研究是支持由美国国立卫生研究院授予R01 HL108880（以AS），R01 DK095029（以OPO）和K99 HL116603（以TSP），全国肾脏基金会IG1724（以TSP），美国心脏协会13GRNT16220002（以OPO）和本·J.里普斯研究奖学金由美国肾脏病学会（至DVI）。

下面描述的实验程序，在威斯康星州和德克萨斯大学健康科学中心休斯敦大学医学院获得批准的机构动物护理和使用委员会，并分别按照卫生指南实验动物的护理和使用国家研究院​​。 图1显示的组织分离和处理过程的主要步骤。简要地说，从PCK或SD大鼠的肾脏用于收集无论是从健康非拨小管或囊肿导管上皮单层的手动隔离。在这里，我们从4-16周龄PCK大鼠10,13研究肾脏。 1.肾囊肿和连接小管（CNT）/隔离集合管（CD）段<ol><li>麻醉实验动物异氟醚（5％的诱导，1.5〜2.5％的维护）/医用级O 2或其他经批准的方法。动物必须不断监控，以确保有足够的文件韦尔麻醉。稳定的呼吸频率和脚趾捏的反应是用来确定适当的麻醉。 </li><li>执行剖腹并通过腹主动脉17冲洗用磷酸缓冲盐水（PBS）的肾脏。 <ol><li>准备一个聚乙烯管导管（PE50），并把它连接到注射泵填充有PBS。切开皮肤和腹壁沿白线，然后使整个腹部横向腹部切口，从一边到另一边倒腾腹部器官用棉签以访问降主动脉与肠系膜分支和腹腔动脉。在进一步的过程滋润五脏六腑用温生理盐水，以防止其干燥。 </li><li>将一个连字（＃1）周围的肠系膜和腹腔动脉，另一结扎（＃2）周围的隔膜下主动脉（不打领带）。轻轻分开一个。腹钝性解剖结缔组织周围薄镊子把两个连写〜3左肾动脉下方毫米（＃3）和上述髂动脉分叉（＃4）。 </li><li>领带结扎＃4和附加周围左肾动脉结扎和＃3之间的主动脉的容器夹具。使钳和结扎＃4导尿主动脉之间的切口，用绷带＃3牢固地固定导管。 </li><li>释放夹紧并确保该脉是在导管可见以确保正确安装。开始灌流以6ml / min的速率，领带连字＃1和＃2，和切断左肾静脉。继续冲洗1-2分钟，直到脏器完全变白。 </li><li>切肾血管，尿道口及其周围结缔组织和脂肪组织用剪刀来收集肾脏。然后作一个简短的撕裂肾囊和剥离肾脏解封他们。将肾脏入冰 - 冷PBS。安乐死是通过开胸手术证实。 </li></ol></li><li>制备涂覆有聚-L-赖氨酸的5×5毫米玻璃盖片。切盖GLA分类用金刚石铅笔和地点大约20微升的0.01％无菌过滤聚-L-赖氨酸溶液到每玻璃芯片。准备生理盐水和两对制表师镊子解剖。 </li><li>切断与沿冠状面刀片肾脏进入1-2毫米厚度的〜切片。放置在立体显微镜下的片段之一。组织的分离应在冰冷盐水来完成。 </li><li>定位在立体显微镜下为圆形状的空腔（图2A）囊肿;他们的墙壁通常含有增生的血管突出的网络。使用细尖镊子解剖囊肿尽可能地薄，得到的单层面积的内部上皮细胞层。它附加到覆盖有聚L-赖氨酸的玻璃片。粘聚-L-赖氨酸表面允许研究者牢牢定位在玻璃内部囊肿层。暴露与顶侧上的囊肿，以提供接入。移液器（图2B）。 </li><li>使用PCK或SD大鼠的孩子内伊中央片含有乳头的非扩张的CNT / CCDsegments 18-21隔离。 注：乳头状组织比皮质和保持乳头管带用钳子和沿径向轴撕裂片可切割为薄部门更持久。个别小管是可见的，并可以拉出到被放置在盖玻璃芯片。 </li><li>识别将CNT / CCD段由分岔，比近端小管和大显着可见的细胞（图2C）更高的透明度。放置附有小管的玻璃盖片上配备有适合驱动微量显微在显微镜下。使用锋利的微量分割开管和连接它们的边缘到玻璃使顶端表面可访问（图2D）。 </li></ol> 2.单通道膜片钳电<ol><li>填充膜片钳室浴溶液和传送护罩玻璃芯片与离体组织到腔室。确保膜片钳微量具有7-10兆欧电阻为可靠的细胞（细胞连接的）测量。 </li><li>对于细胞贴附测量，将放大器的增益比20倍，并通过一个八极贝塞尔滤波器低通的电流，在300赫兹。对于ENaC的频道监测，使用一个浴溶液，以mM：150的NaCl，1的CaCl 2，2的MgCl 2，10 HEPES（pH 7.4）中;吸移管：140的LiCl，2的MgCl 2和10的HEPES（pH 7.4）中。 </li><li>进行常规的膜片钳实验中一个细胞贴附模式10。选择在上皮单层的细胞并接近吸管顶膜。形成通过施加轻柔抽吸吸管和细胞膜之间的高电阻密封。一旦高耐千兆欧姆密封形成，在保持电位的间隙 - 自由协议应启动针对感兴趣的信道的监视活动。 </li><li>从千兆存储的无间隙的单通道电流数据欧姆密封件进行后续分析。分析使用一般用膜片钳设置18提供的软件包的渠道活动。计算信道活性NPO其中N是指在贴片和P 2 O的活性通道的数量是信道的平均开放概率。 注：使用孤立囊肿或小管在膜片钳实验中不超过30分钟。 </li></ol>细胞内钙离子浓度的上皮细胞3成比例落射荧光测量<ol><li>使用5mM的的Fura-2AM溶解在DMSO中。等分试样原液成单独的500μl的锥形管中（约10微升）。从光线并存储在冰箱在-20℃下长达半年的保护。 </li><li>在PSS孵育孤立囊肿和分裂开管30-40分钟（毫米：145氯化钠，氯化钾4.5，2 氯化镁 ，氯化钙2 2和 10 HEPES pH值为7.35），含5微 ​​米的Fura-2 AM染料和0.05％聚醚酸有助于驱散乙酰氧基甲基酯。为此，含有装载鸡尾酒地方的组织在3.5厘米培养皿，避光孵育一个缓慢摇动器上在室温下进行。 </li><li>改变的Fura-2 AM含有媒体孵育后清洗PSS和放置组织，在显微镜下以进一步执行萤光成像。 </li><li>打开CCD相机和稳定的光源（单色系统）配备了滤光轮（每个过滤器的位置可以有自己的衰减水平，选择每一个过滤器被调用时，相关联）。 </li><li>查找在明视场组织。切换到检测荧光信号和调整用中性密度过滤器和灯功率，以避免信号的饱和度的光源的强度。 </li><li>监视与比率激励的组织样品中的Fura-2 AM荧光在三百八十○分之三百四十○纳米，具有0.125 Hz或更高的频率。使用40×/ NA 1.3或类似的物镜正确的解像度化形象。 </li><li>用于图像处理和计算导入图像序列。确保分裂渠道和使用hyperstack灰度模式。选择几个感兴趣的区域（单囊细胞或囊状组织选定的区域），并计算强度值每通道（340和380纳米）转换成首选数据分析软件;减法背景的强度值从每个数据点。 </li><li>对于每个时间点计算出的Fura-2 AM 340〜380信道的强度的比率。地块分散/的钙瞬变每个地区的线路点时间的变化，并计算平均值/ SE值。 </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

我们在这里描述的传统膜片钳技术和表面荧光钙成像的应用程序从ARPKD的鼠的遗传模型导出囊性上皮单层。该协议包括三个步骤，其中最应引起重视的囊肿（协议节的步骤1.5）的隔离和电生理研究。这些关键步骤需要大量的训练和耐心，读者不应该立刻感到沮丧。 首先，最要注意的囊肿单层隔离的过程。制备的这一部分需要手工技巧和显著影响进一步的工作，作为检体和其连...

离子通道在许多生理功能，包括细胞生长和分化中发挥显著作用。常染色体显性和隐性多囊肾疾病（ADPKD和ARPKD，分别）是其特征在于，所述的肾小管上皮细胞起源的肾流体填充囊肿的发展遗传性疾病。多囊肾是由PKD1或PKD2编码polycystins 1和参与细胞增殖和分化的调节如图2所示，膜蛋白的突变引起的。 PKD2本身或作为与PKD1一个复杂也发挥作为钙 -permeable阳离子通道1。所述PKHD1基因编码fibrocystin（涉及小管和/或维持上皮极性的纤毛相关受体样蛋白）的突变是ARPKD 2的遗传动力。囊肿生长是一个复杂的现象，伴随着不安扩散3,4，5血管生成，分化和极性损失性肾小管细胞6-8。 有缺陷的再吸收和分泌增强囊性上皮有助于在管腔和囊肿膨胀9,10-流体积聚。受损的流量依赖性钙离子浓度我的信号也已PKD 11-15时挂cystogenesis。 这里，我们描述适用于单通道活性和细胞内Ca 2+水平的囊性上皮单层从PCK大鼠分离的膜片钳测量的方法。这种方法成功地被我们用于表征上皮细胞钠离子通道（ENaC的）10的活性和钙离子浓度依赖我引起的钙 -permeable TRPV4和嘌呤信号级联13处理 。 在这些研究中，我们使用的PCK大鼠，模型ARPKD引起的在PKHD1基因的自发突变。该PCK应变originallÿ从的Sprague-Dawley（SD）大鼠16从而SD大鼠被用作适当的控制用于 ​​与PCK应变比较而得。其结果是，既大鼠肾段和非扩张集合管从同一PCK大鼠分离可以作为两个不同的比较组对囊性上皮实验。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1015">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Fura-2 AM</td>
			<td style="width:219px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:183px;">F-14185</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Flou-8</td>
			<td style="width:219px;">AAT Bioquest</td>
			<td style="width:183px;">21091</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Poly-L-lysine</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:183px;">P4707</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Pluronic acid</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:183px;">F-68&#160;</td>
			<td style="width:333px;">solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Shaker</td>
			<td style="width:219px;">Boekel Scientific</td>
			<td style="width:183px;">260350</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Light source</td>
			<td style="width:219px;">Sutter Instrument Co</td>
			<td style="width:183px;">Lambda XL</td>
			<td style="width:333px;">with integrated shutter/filter wheel driver</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Neutral density filters</td>
			<td style="width:219px;">Nikon</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:333px;">ND4, ND8</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Objective</td>
			<td style="width:219px;">Nikon</td>
			<td style="width:183px;">SFluo&#160;</td>
			<td style="width:333px;">40/1.3 DIC WD 0.22&#160;&#160; oil</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Camera</td>
			<td style="width:219px;">Andor Technologies</td>
			<td style="width:183px;">Zyla sCMOS</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:283px;">Nikon&#160; microscope (inverted)</td>
			<td style="width:219px;">Nikon</td>
			<td style="width:183px;">Nikon Eclipse TE2000-S</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Cover Glass</td>
			<td style="width:219px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:183px;">6661B52</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Diamond pencil</td>
			<td style="width:219px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:183px;">22268912</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Image acquisition software</td>
			<td style="width:219px;">Nikon</td>
			<td style="width:183px;">Nikon NIS-Elements&#160;</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:283px;">Image analysis software</td>
			<td style="width:219px;">ImageJ</td>
			<td style="width:183px;">http://imagej.nih.gov/</td>
			<td style="width:333px;">ND Utility plugin allows to import images in the native Nikon Instruments .nd2 format</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Recording/perfusion chamber</td>
			<td style="width:219px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:183px;">RC-26</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;"></td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Patch Clamp amplifier</td>
			<td style="width:219px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:183px;">MultiClamp 700B</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Data Acquisition System</td>
			<td style="width:219px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:183px;">Digidata 1440A</td>
			<td style="width:333px;">Axon Digidata&#174; System</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Low Pass Filter</td>
			<td style="width:219px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:183px;">LPF-8</td>
			<td style="width:333px;">8 pole Bessel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Borosilicate glass capillaries</td>
			<td style="width:219px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:183px;">1B150F-4</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:283px;">Micropipette Puller</td>
			<td style="width:219px;">Sutter Instrument Co</td>
			<td style="width:183px;">P-97</td>
			<td style="width:333px;">Flaming/Brown type micropipette puller</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Microforge</td>
			<td style="width:219px;">Narishige</td>
			<td style="width:183px;">MF-830</td>
			<td style="width:333px;">Japan</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Motorized Micromanipulator</td>
			<td style="width:219px;">Sutter Instrument Co</td>
			<td style="width:183px;">MP-225</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Inverted microscope</td>
			<td style="width:219px;">Nikon</td>
			<td style="width:183px;">Eclipse Ti</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Microvibration isolation table</td>
			<td style="width:219px;">TMC</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:333px;">equipped with Faraday cage</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Multichannel valve perfusion system</td>
			<td style="width:219px;">AutoMake Scientific</td>
			<td style="width:183px;">Valve Bank II</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Recording/perfusion chamber</td>
			<td style="width:219px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:183px;">RC-26</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Software</td>
			<td style="width:219px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:183px;">pClamp 10 . 2</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;"></td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Temperature controlled surgical table&#160;</td>
			<td style="width:219px;">MCW core</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:333px;">for rodents</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Binocular stereomicroscope</td>
			<td style="width:219px;">Nikon</td>
			<td style="width:183px;">SMZ745</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Syringe pump-based perfusion system</td>
			<td style="width:219px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">polyethylene tubing</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:183px;">PE50</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Isofluorane anesthesia</td>
			<td style="width:219px;"><a href="http://www.vetequip.com/">http://www.vetequip.com/</a></td>
			<td style="width:183px;">911103</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;"></td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Other basic reagents</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

implementing patch clamp and live fluorescence microscopy to monitor functional properties of freshly isolated pkd epithelium

期间多囊肾囊肿萌生和扩展是一个复杂的过程，其特征在肾小管细胞增殖，管腔流体积累和细胞外基质的形成异常。离子通道和细胞内钙信号的活动是决定的肾小管上皮细胞功能的关键生理参数。我们开发适合于实时观察离子通道的活性与在上皮单层从肾囊肿新鲜分离的细胞内Ca 2+水平膜片钳技术和登记的方法。 PCK大鼠的常染色体隐性遗传性多囊肾病（ARPKD）遗传模型，这里被用作离子通道和钙流的体外分析。这里描述的是详细的一步一步的步骤旨在隔离囊性单层和非扩张管从PCK或正常只SD（SD）大鼠，并监视单通道活性和细胞内Ca 2+动力学。此方法不需要酶加工，并允许在分析新鲜分离的上皮单层的天然环境。此外，这种技术是将细胞内钙的变化非常敏感，并生成高分辨率的图像进行精确的测量。最后，分离的囊性上皮可进一步用于与抗体或染料，制备原代培养物的纯化和关于各种生化分析染色。

潜在的ENaC参与cystogenesis已经证明了几项研究观察到了破坏表皮生长因子（EGF）在PKD进展22-25和异常钠重吸收在ARPKD鼠模型和组织培养26-28信令。例如，Veizis 等人表明，阿米洛利敏感的 Na +吸收在光盘细胞ARPKD 29的非直系同源BPK小鼠模型下降。我们最近证明，受损的钠和水的重吸收的孢囊是在加重cystogenesis 10的一个重要因素。具体来说，我们采用电生理...

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Implementing Patch Clamp and Live Fluorescence Microscopy to Monitor Functional Properties of Freshly Isolated PKD Epithelium

表现在肾小管上皮细胞离子通道在多囊肾病的病理一个显著的作用。这里，我们描述用于执行囊性上皮从啮齿动物肾脏新鲜分离的膜片钳分析和细胞内钙水平的测量的实验方案。

实施膜片钳和活荧光显微镜监视新鲜分离的PKD上皮细胞的功能特性

Cyst initiation and expansion during polycystic kidney disease is a complex process characterized by abnormalities in tubular cell proliferation, luminal ...

implementing-patch-clamp-live-fluorescence-microscopy-to-monitor

Research

JoVE Journal

Biology

9.7K 次观看.  Medical College of Wisconsin. 表现在肾小管上皮细胞离子通道在多囊肾病的病理一个显著的作用。这里，我们描述用于执行囊性上皮从啮齿动物肾脏新鲜分离的膜片钳分析和细胞内钙水平的测量的实验方案。 