全场光学相干显微镜，用于角膜移植物基质特征的组织学样分析

该方法可以改善眼库中角膜供体组织的筛选和选择，增强角膜移植的效果。该技术的主要优点是其高分辨率评估能力，并且角膜在整个图像采集过程中始终浸入充满存储介质的封闭腔室中，从而降低了任何潜在的污染风险。演示该程序的将是Maelle Vilbert，我们实验室的博士毕业生。

首先，将角膜浸入样品架中的储存培养基中，上皮朝上。将样品架随附的干净二氧化硅盖玻片放在角膜顶部。然后，通过轻轻转动支架的底座来关闭支架，直到样品稍微变平并固定在盖玻片下，提供相对均匀的成像表面。

采取预防措施以避免任何气泡。在盖玻片上涂上一层厚厚的眼科或光学凝胶作为浸没介质。通过打开设备背面的电源开关来初始化设备。

设备正面的绿色 LED 亮起表示电源已打开。确保成像载物台畅通无阻，可移动托盘除外。然后在采集软件中单击“确定”，在提示符下初始化电机。

要设置设备，请在指定字段和必填字段中输入示例标识符。并选择性地输入样本描述和研究描述。接下来，单击“获取宏图像”以创建样本的快照，该快照稍后可用于横向定位和导航目的。

满意后，在提示符下单击“是”验证图像。之后，设备将样品盘移动到物镜下方并执行自动调整。在继续操作之前，请确保显微镜物镜充分浸入光学凝胶中。

通过转到“探索”选项卡来准备购置。在获取一堆图像之前，请通过操纵杆或屏幕上的手动选择导航到角膜中心。通过旋转操纵杆、调整滑块或在图形用户界面中手动输入键盘来改变成像深度。

然后将平均值调整为 40 以获得最佳角膜成像。在深度字段中输入角膜表面值或第一个图像位置。然后选择“获取”选项卡以获取图像。

选择并设置与设备的轴向分辨率匹配的切片间距。在“层数”下输入角膜厚度值。查看参数和采集时间。

满意后，按 OK 启动收购。在采集过程中，避免接触显微镜所在的工作台。为了评估基质和鲍曼层厚度，测量角膜横截面的距离。

例如，按照文本手稿中的说明，在横截面上添加五个等间距的点。根据默认视野在已知距离的两个点之间画一条线。然后转到“分析”选项卡并选择“设置比例”。

在相应的字段中输入已知的距离和长度单位。设置为 1024 像素或 780 微米，然后单击确定。在两个未知距离的点之间画一条线，并直接从状态栏读取测量的长度或距离。记录均值和变异系数。

单击“图像”选项卡，然后选择“堆栈”下的“重新切片 Z”以确定角质形成细胞密度。这将把基质面部图像分成七组，以产生厚度相当的切片。为了进一步分析，包括最前部基质的所有可用面切片、前基质的 15 张图像、中基质的 5 张图像和后基质的 5 张图像。

在每个面图像上，选择一个 300 x 300 微米的感兴趣区域。要增强细胞核可视化效果，请使用“编辑”选项卡下的“反转”反转图像。通过单击图像选项卡并导航到亮度对比度来调整对比度和亮度。

要手动计数细胞核，请转到插件并导航到分析选项卡下的细胞计数器。 按初始化，然后选择计数器类型。然后通过单击倒置图像中的深色椭圆形特征来计数细胞核，考虑那些仅针对图像四个边中的两个落在图像边框上的细胞核。

选定的人类供体角膜在器官培养基中储存后肿胀，给出了水肿角膜的病理生理模型，并且由于穿透深度有限，无法通过整个角膜厚度获取图像。转移到补充器官培养基的糊精，减轻肿胀并导致正常厚度的供体角膜。病变角膜通过形态变化和典型的基质特征被识别，包括可变基质厚度或鲍曼层的减少。

使用全场光学相干显微镜进一步帮助对角质形成细胞密度和基质反射率进行评估，并进一步帮助组织学样分析和区分正常角膜组织与病理性角膜组织，这超出了临床光学相干断层扫描系统的能力。观看此视频后，您应该对如何对角膜基质进行定性和定量的组织学样分析有很好的了解，从而将疾病与正常人角膜组织区分开来。