이 방법은 안구 은행에서 각막 기증자 조직의 스크리닝 및 선택을 개선하고 각막 이식 결과를 향상시킬 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 고해상도 평가 기능과 각막이 이미지 획득 전반에 걸쳐 저장 매체로 채워진 밀폐된 챔버에 잠겨 있어 잠재적인 오염 위험을 줄인다는 것입니다. 이 절차를 시연하는 것은 우리 연구실의 박사 학위 졸업생 인 Maelle Vilbert가 될 것입니다.
시작하려면 저장 매체에 담근 각막을 샘플 홀더에 놓고 상피가 위를 향하도록 합니다. 샘플 홀더와 함께 제공된 깨끗한 실리카 커버 슬립을 각막 위에 놓습니다. 그런 다음 샘플이 약간 평평해지고 커버 슬립 아래에 고정되어 비교적 균일한 이미징 표면을 제공할 때까지 베이스를 부드럽게 돌려 홀더를 닫습니다.
기포가 발생하지 않도록 주의하십시오. 침지 매체로 커버 슬립에 안과용 또는 광학 젤의 두꺼운 층을 적용합니다. 장치 뒷면의 전원 스위치를 켜서 장치를 초기화합니다.
장치 전면에 녹색 LED가 켜지면 전원이 켜져 있음을 나타냅니다. 이미징 단계가 깨끗한지 확인하십시오.tage, 이동식 트레이를 제외하고. 그런 다음 수집 소프트웨어에서 OK를 클릭하여 프롬프트에서 모터를 초기화합니다.
장치를 설정하려면 지정 및 필수 필드에 샘플 식별자를 입력합니다. 그리고 선택적으로 샘플 설명과 연구 설명을 입력합니다. 그런 다음 매크로 이미지 획득을 클릭하여 나중에 측면 위치 지정 및 탐색 목적으로 사용할 수 있는 샘플의 스냅샷을 만듭니다.
만족스러우면 Yes(예)를 클릭하여 프롬프트에서 이미지의 유효성을 검사합니다. 그런 다음 장치는 대물렌즈 아래로 샘플 트레이를 이동하고 자동 조정을 수행합니다. 계속 진행하기 전에 현미경 대물렌즈가 광학 젤에 잘 잠겨 있는지 확인하십시오.
탐색 탭으로 이동하여 획득을 준비합니다. 이미지 스택을 획득하기 전에 조이스틱 또는 화면의 수동 선택을 통해 각막 중앙으로 이동합니다. 조이스틱의 회전, 슬라이더의 조정 또는 그래픽 사용자 인터페이스의 수동 키보드 입력을 통해 이미징 깊이를 변경합니다.
그런 다음 최적의 각막 이미징을 위해 평균값을 40으로 조정합니다. 각막 표면 값 또는 첫 번째 이미지 위치를 깊이 필드에 입력합니다. 그런 다음 획득 탭을 선택하여 이미지를 획득합니다.
장치의 축 해상도와 일치하는 슬라이스 간격을 선택하고 설정합니다. 조각 수(Number of Slices)에 각막 두께 값을 입력합니다. 매개변수 및 획득 시간을 검토합니다.
만족스러우면 OK(확인)를 눌러 획득을 시작합니다. 획득하는 동안 현미경이 놓인 테이블과의 접촉을 피하십시오. 기질 및 Bowman의 층 두께를 평가하려면 각막 단면의 거리를 측정하십시오.
예를 들어, 본문 원고에 설명된 대로 횡단면에 동일한 간격의 점 5개를 추가합니다. 기본 시야에 따라 알려진 거리의 두 점 사이에 선을 그립니다. 그런 다음 분석 탭으로 이동하여 배율 설정을 선택합니다.
해당 필드에 알려진 거리와 길이 단위를 입력합니다. 1024픽셀 또는 780마이크로미터로 설정하고 확인을 클릭합니다. 거리를 알 수 없는 두 지점 사이에 선을 긋고 상태 표시줄에서 직접 측정된 길이 또는 거리를 읽습니다. 변동의 평균과 계수를 기록합니다.
이미지(Image) 탭을 클릭하고 스택(Stacks)에서 Z 리슬라이스(Reslice Z)를 선택하여 각질세포 밀도를 확인합니다. 이렇게 하면 비슷한 두께의 슬라이스를 생성하기 위해 7개의 그룹으로 구성된 얼굴 이미지를 합산합니다. 추가 분석을 위해 가장 앞쪽 기질에 대해 사용 가능한 모든 안면 슬라이스, 전방 기질에 대한 15개 이미지, 중간 기질에 대한 5개 이미지 및 후방 기질에 대한 5개 이미지를 포함합니다.
각 면이 있는 이미지에서 300 x 300마이크로미터 크기의 관심 영역을 선택합니다. 핵 시각화를 향상시키려면 편집 탭에서 반전을 사용하여 이미지를 반전합니다. Image(이미지) 탭을 클릭하고 Brightness-Contrast(밝기-대비)로 이동하여 대비와 밝기를 조정합니다.
세포핵을 수동으로 계수하려면 플러그인(Plugins)으로 이동하여 분석(Analyze) 탭 아래의 셀 카운터(Cell Counter)로 이동합니다. 초기화를 누른 후 카운터 유형을 선택합니다. 그런 다음 반전된 이미지에서 어두운 타원형 특징을 클릭하여 세포핵을 계산하고 이미지의 4면 중 2면에 대해서만 이미지 테두리에 착륙하는 것을 고려합니다.
선택된 인간 기증자 각막은 장기 배양 배지에 보관한 후 팽윤시켜 부종성 각막의 병태생리학적 모델을 제공하고 제한된 침투 깊이로 인해 전체 각막 두께를 통한 이미지 획득을 방지했습니다. 덱스트린이 보충된 장기 배양 배지로 옮기고 부종을 감소시키고 정상 두께의 기증자 각막을 생성했습니다. 병든 각막은 다양한 기질 두께 또는 Bowman's layer의 감소를 포함하여 형태학적 변화와 전형적인 기질 특징으로 인식되었습니다.
각질세포 밀도 및 기질 반사율의 평가는 임상 광간섭 단층촬영 시스템의 기능을 넘어서는 전장 광간섭 현미경을 사용하여 조직학과 유사한 분석 및 병리학적 각막 조직의 정상 각막 조직의 분화에 더욱 도움이 되었습니다. 이 비디오를 본 후에는 정상 인간 각막 조직과 질병을 구별할 수 있는 각막 기질에 대한 정성적 및 정량적 조직학과 같은 분석을 수행하는 방법을 잘 이해해야 합니다.
