저자 그들의 지원, S. A. 뮐러 중요 한 토론 및 신중 하 게 읽고 원고, A. Fecteau-LeFebvre EM, 리카 르도 Adaixo, 프랭크와 기술 지원에 대 한 바젤 대학의 Biozentrum의 워크샵을 감사 하 고 싶습니다. 레만 막 단백질에 대 한 테스트 샘플 (C-중국, Biozentrum, 바젤의 대학에서 모두)와 A. 엥 겔, 그의 영감 대화에 대 한 명예 대학 바젤. 테스트 샘플 P. Ringler, M. A. 제공한 친절 하 게 Mahi, T. Schwede (Biozentrum, 바젤의 대학), P. Leiman (구조 생물학 및 생물 물리학, EPFL의 실험실) 및 R. 디아즈-아 (뉴욕 구조상 생물학 센터, 미국). 프로젝트는 스위스 Nanoscience 연구소 (SNI, 프로젝트 P1401, ARGOVIA 프로젝트 MiPIS)와 스위스 국립 과학 재단 (SNF, 프로젝트 200021_162521)에 의해 지원 되었다.

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저자 스테판 A. 아놀드, 헤 닝 Stahlberg와 토마스 브라운 선언 다음 경쟁 금융 이자: cryoWriter 개념은 부분의 특허 출원 PCT / EP2015/065398 및 EP16194230.

'CryoWriter' 악기와 샘플 격자에 대 한 NS 및 곳을 알아내는-EM 크기 nL 총 샘플 볼륨에서 준비 하 고 고전적인 종이 blotting 단계를 완전히 방지 하는 데 필요한 프로토콜도 제공 됩니다. 미세 원칙과 micromechanical 시스템은 이것을 가능 하 게 cryoWriter에 결합 됩니다.
우리의 경험을 보여줍니다이 원고에 소형된 메서드를 사용 하면 EM-그리드 준비에 대 한 매개 변수 공간 고아 한 방법, 그리고 엄격한 사용자 통제 보다 큰. 중요 한 것은, 달성 증가 재현성 샘플 버퍼 시스템, 실제 실험을 수행 하기 전에 최적의 매개 변수를 확인 하기 위해 쉽게 사용할 수 있는 테스트 단백질 보충 사전 검열 수 있습니다. 이 최소는 절대 관심의 샘플의 소비를 유지 하 고는 것이 좋습니다. 두 NS 및 곳을 알아내는 EM 그리드 준비에 대 한 중요 한 단계는: (i) 못쓰게 펌프 시스템; 하위 nanoliter 볼륨 분배, 시스템의 액체 (물) 고 해야 합니다 degassed 무료 거품. (글로우 방전의 플라즈마 청소 단계; ii) 정밀 하 게 제어 그들 격자의 표면 특성은 재현성 결과 위해 중요 한. (iii) 샘플 컨디셔닝; 컨디셔닝, 예를 들어, NS와 필요한 시간은 microcapillary24의 노즐 형상에 뿐만 아니라 버퍼 유형, 소금 콘텐츠 및 농도 (그림 3)에 따라 달라 집니다. (4) 증발 속도 NS EM 양적 EM;에 대 한 준비에 대 한 커피 고리 효과 NS 그들 준비의 정량 분석을 금지 수 있습니다 그리고 느린 증발 속도 DP-단계에 의해 제어에 의해 억압 해야 합니다.
제시 그리드 준비 방법의 다른 측면은 특정 샘플에 대 한 다양 한 프로토콜의 개발을 수 있도록 자유롭게 결합 수 있습니다. 전형적인 예는 cryo-EM;에 대 한 그리드 준비 전에 컨디셔닝 단계 고해상도 그들, 예를 들어, 글리세롤, 방지 하는 물질의 제거 될 것 이라고 ligands는 격자 준비가; 전에 컨디셔닝에 의해와 같은 중재자 분자의 도입 또는 단일 세포 lysate 여 NS 또는 곳을 알아내는-EM (그림 6)의 검사.
마이크로 및 제시 방법에 최소한의 샘플 금액을 사용 하 여 완전히 종이 blotting 단계에 대 한 필요성을 제거합니다. 이것은 큰 장점은 종이 럽은 단백질, 잠재적으로 원치 않는 이온 샘플 오염 및 본질적으로 이어지는 대규모 샘플 손실에 대 한 가혹한 치료 때문. 다른 한편으로, 잠재적으로 형성 하는 곳을 알아내는-EM 샘플 고전적인 방식으로 준비가 때 얇은 샘플 영화의 공기-물 인터페이스에 의해 발생 하는 효과 cryoWriter 사용 하는 경우를 방지 하지 됩니다. 곳을 알아내는-그들에 대 한 적합 한 격자는 샘플 응용 프로그램 및 vitrification (데이터 표시 되지 않음) 사이의 미만 0.2 s 대기 시간으로 준비 수 있습니다. 그러나, 단백질 보급에 의해 몇 나노초에 나노미터의 몇 가지 tenths 여행, 아직 충분 한 시간이 있다 100 nm 두꺼운 샘플 영화의 공기-물 인터페이스와 여러 번 충돌 하. 그러나, 공기-물 인터페이스에 집착 하는 단백질의이 짧은 시간 간격으로 크게 줄어들 수 있습니다 및 단백질 변성을 방지 수 있습니다 또는 입자 방향 제한. 공기-물 인터페이스에서 중요 한 단백질을 보호할 수 있습니다 또 다른 유망한 방법은 낮은 분자량 표면 활성 물질에 의해 샘플 영화를 커버입니다. 이러한 화합물 그리드 준비 하기 전에 cryoWriter에서 컨디셔닝 단계 빠르게 도입 될 수 있습니다. 미세 시스템의 높은 표면 볼륨 비율 샘플 microcapillary 표면에 난다 흡착에 의해 잠재적으로 손실 될 수 및 입자를 계산 하 여 정량 분석을 방해로 cryoWriter의 더 한계입니다. 문제는 두 가지 방법으로 해결: 먼저, 샘플은 microcapillary 내에서 긴 거리를 여행 하지 않습니다. 실제로, nanoliter 샘플 볼륨 처리를 통해 모 세관 끝에 남아 있습니다. 둘째, 셋째 비교적 큰 내부 직경, 예를 들어, 180 µ m.와 microcapillaries을 사용 하 여 볼륨 비율을 감소 추가,는 microcapillaries의 표면 필요한 경우 쉽게 패 수 있습니다 예를 들어, 그들을 치료 하 여 상업적으로 사용 가능한 polylysine 에탄올 glycols (PLL-PEG)와 함께
EM에 사용 되는 단일 입자 접근 방식에 의해 단백질의 고해상도 분석에는 개별 단백질 입자의 몇 백만 이미지 100000을 필요 합니다. 즉, 미세 기술 구조 조사에 대 한 충분 한 단백질 복합물을 제공할 수 있습니다. 단백질 복합물 (약 1 시간) 최소 셀 금액 (약 40, 000 셀)에서 빠른 격리에 대 한 소형된 면역-강수량 메서드 이전28개발 되었다. 이 메서드는 cryoWriter의 소형된 샘플 준비 단계에 직접 연결 됩니다 이제. 최종 목표는 모든 미만 2 시간을 요구 하는 빠른 단백질 분리 및 곳을 알아내는-EM 그리드 준비에 대 한 통합 된 미세 파이프라인을 개발 하는 것입니다. 또한, 그림 6, 분 양과 샘플 준비와 거의 무손실 컨디셔닝 및 그리드 준비 절차는 cryoWriter를 사용 하 여 달성에 필요한 자료의 볼륨에 의해 증명으로 가능 하 게 단백질 연구 개별 셀 단지 함께, 소형된 면역-강수량 메서드와 cryoWriter 같이 우리가 최근 열 충격 실험24"단일 셀 시각적 proteomics" 라는 새로운 단백질 방법의 기초를 하다. 데이터 분석 알고리즘 "비주얼 proteomics" 이미지의 분석에는 현재 테스트 되 고.

하드웨어 및 소프트웨어 전송 전자 현미경 (TEM)에 의해 단백질 복합물의 구조 분석에 대 한 대규모 최근 몇 년 동안 선진 했다. 개선 사항을 "해상도 혁명"1,2 도를 포장 하 고 근본적으로 구조 연구를 변경. Cryo 전자 현미경 검사 법 (cryo-EM)3,4, 방사선 민감도 감소 방지 하는 동안 생리 적 조건에 가까운 아래 생물 샘플의 준비를 허용의 도래와 함께 시작 하는 혁명 높은 진공에 샘플 증발 전송 전자 현미경5 다음 년에서 증분 기술 진보는 점차적으로 달성 해상도 증가. 이러한 혁신 중 필드-방출 총6,7, 적용 되었고, 더 최근에, 최대 가능성 방법8,9등 데이터 분석 알고리즘을 개선. 직접 전자 탐지기 카메라10,11,,1213, 영화 모드 이미징 및 동반 소프트웨어 개발14,15, 16 , 단일 입자 분석 (대 한 검토 보고 챙, Grigorieff, 외. 생물 학적 샘플에 대 한 원자 해상도 달성 하는 데 필요한 마지막 돌파구를 제공 하는 17, 18). 곳을 알아내는-그들의 중요성 최근 개척자의 3 화학을 위한 노벨상의 포상에 의해 인식 되었다.
가장에 의해 생물 학적 샘플 이미지, 샘플 (이후 "그리드 준비" 라고도 함) 안에 그리드를 로드 하는 데 사용 하는 방법 결과 샘플 레이어 (i) 충분히 얇은 인지 확인 해야 합니다 (< 100 nm) 흩어져 탄력에 의해 광범위 한 소음을 방지 또는 곱하기 전자 현미경의 높은 진공을 견 디는 전자, (ii)와 (iii) 방사선 손상에서는 생체를 보호 합니다. 두 가지 주요 방법 이러한 빌드하거나 수행 하는 데 사용 됩니다: 부정적인 얼룩(NS)19,20 절차 (그림 1A) 얇은 탄소 필름 샘플을 흡착, 비정 질 중 금속에는 생체를 포함 그리고 어셈블리 공기에 건조를 허용 합니다. 이것은 간단 하 고 빠른, 그리고 로드 EM 격자 (이후 "샘플 격자" 라고도 함)는 쉽게 저장 하 고 시간의 연장된 기간에 대 한 유지 될 수 있다 (일반적으로 년). 가장, 준비 NS 인해 높은 콘트라스트를 전시 하 고, cryo-준비 보다 더 높은 전자 복용량을 용납 하지만 해상도 약 20 Å. Cryo-EM 절차 (그림 1B) 고용 홀리 탄소 지원 제한. 샘플 솔루션의 박막 구멍에 걸쳐 스팬 및 EM 그리드 제, 일반적으로 액 화 탄을 급속 하 게 그것은-150 ° c에 뛰어들었다 결과 아 몰 퍼스, vitrified, 50 ~ 100 nm 두꺼운 필름 지원 구멍에서 솔루션의. 이 얇은, 비정 질 영화 견 디는 전자 현미경에서 높은 진공으로, 이상적인 케이스에서 그들의 네이티브 국가에서 생물 학적 구조 합니다. 프로시저에서 고해상도 이미지를 생물 학적 샘플 수 있습니다. 그러나, 샘플 그리드 유지 되어야 한다 온도 아래에서-150 ° C 깡통을 피하기 위해 모든 시간에. 때문에 낮은 온도, 하지만 대비 상대적으로 높은 전자 복용량을 사용 하 여 이미지 수 이며 신호 대 잡음 비율 역시 낮은. 따라서 평균 기술 대비 증가 고용 하 고, 고해상도 3 차원 (3D) 지도 제공 하는 샘플은 다른 각도에서 몇 군데, 개축 될 수 있다. 가장 일반적으로 사용 하 고 매우 성공적인 지금 3D 재구성 방법은 단일 입자 접근. 최근 검토 쳉 여러분18참조.
부정적인 얼룩 가장 (NS-EM) 인지 검사 및 품질 관리에 대 한 중요 한 높은 콘트라스트 필요할 때 제한 된 양의 샘플을 사용할 수 있는 경우 (흡착 탄소 필름에 일반적으로 집중 하 고 샘플). 단일 입자 cryo-그들은 단백질 구조의 고해상도 3D 복원에 대 한 겨냥 한 경우 골드 표준 방법입니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57310/57310fig1.jpg"> 그림 1: 원리의 가장 그리드 준비 및 클래식 (패널 A, B)와 미세 접근 (패널 C, D) 사이 비교. A) 클래식 NS-EM 그리드 준비: 샘플의 µ L 3에 대 한 지속적인 탄소 필름 (이후에 'NS-EM 격자' 라고도 함)으로 덮여는 그들 격자에 손으로 pipetted는 (i). 약 10 부 화 후 s, 필터 종이 얇은 물 필름에 흡착된 생체를 떠나 측면 (ii)에서 과잉 액체를 멀리 오 점 하는 데 사용 됩니다. 그 후, 단백질 중 금속 소금 솔루션, 예를 들어, 20 2 %uranyl 아세테이트 incubated s (iii), 그리고 다시 액체 필터 종이 (iv)를 사용 하 여 측면에서 blotting에 의해 제거 됩니다. 마지막으로, EM-그리드 건조 한 공기에 남아. B) 클래식 cryo-EM 그리드 준비: 샘플에 대 한 3 µ L 홀리 탄소 필름에 손으로 pipetted는. 얇은 샘플 영화를, 과잉 액체 종이 blotting 얼굴-에 의해 하나 또는 양쪽 (ii)에서 제거 됩니다. 마지막으로, 격자는 급속 하 게 속으로 뛰어들었다 vitrification (iii)에 대 한 액체 탄. C) cryoWriter 설정을 사용 하 여 NS-EM 그리드 준비: A 5 nL 볼륨 (i) microcapillary를 사용 하 여 샘플 재고에서 발음. 샘플 컨디셔닝, microcapillary 팁은 컨디셔닝 솔루션으로, 예를 들어, 2% 염화 아세테이트 포장 되어있습니다. 이온 및 작은 분자 확산 (ii)로 교환 됩니다. 참고는 microcapillary의 크기는 전체 프로세스를 구동 하는 보급을 보장 하는. 단백질 소금 이온 보다 훨씬 낮은 확산 상수 있고24를 크게 잃지는. 마지막으로, 샘플 격자에 적절 하 게 이며 (iii) 건조 수 있었습니다. D) cryoWriter 기반 방법을 사용 하 여 곳을 알아내는-EM 그리드 준비의 원칙: 홀리 탄소 필름으로 커버는 그들 격자 온도 제어 플랫폼의 표면에 놓이고 핀셋에 의해 개최. 플랫폼의 온도 노점 온도 그리드 환경에서 오프셋에서 제어 됩니다. 그리드 샘플을 포함 하는 microcapillary를 기준으로 이동 하 고는 microcapillary 그리드 위에 몇 마이크로미터까지 낮춘 다. 그 후, 샘플의 몇 nanoliters는 적절 하 게 그것에서 무대 나선형 패턴;에 이동 하는 동안 과잉 액체는 다시 발음 (i). 못쓰게는 그들 격자 후는 microcapillary 철회 하 고 격자 온도 제어 플랫폼에서 (그 후이 슬 포인트 (DP) 단계 라고 함) 제어 양의 샘플 증발을 허용 하도록 짧은 시간 동안 남아 있습니다. 동결 하는 식이 대 한 그리드 빠르게 핀셋 (ii)를 사용 하 여 스테이지에서 철수, 수직 위치에 90 °에 의해 뒤집힌 이며 제 목욕 (iii) (이후 ' 선택 및 식이 ' 메커니즘 이라고 함)으로. <a href="/files/ftp_upload/57310/57310fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
불행히도, NS 및 곳을 알아내는-EM 사용 그리드 준비 방법은 그들은 발명 이후 크게 개선 하지 했습니다. 현재 단점 높은 샘플 소비 (1 mg/mL 단백질의 약 3 µ L) 이며 샘플의 다량 (> 99%) (그림 1A, B)를 잃었다. 또한, 클래식 cryo-그들에 대 한 격자를 준비 하는 데 사용 방법은 단백질에 대 한 가혹한 절차: 먼저, 그것은 포함 한 광범위 한 얼굴에 종이 blotting 단계 (그림 1B, ii), 그리고, 둘째, 단백질은 공기-물 인터페이스에 노출 되 21의 상당한 양에 대 한입니다. 여기, 사전 조건 샘플에 대 한 다른 방법, 샘플 그리드 준비 및 사후 처리 (그리드 건조 또는 vitrification) NS-EM (그림 1C) 또는 곳을 알아내는-EM (그림 1D)에 대 한 제공 됩니다. "CryoWriter" 라는 자체 내장된 설치 소형된 샘플 처리 기술 및 미세 원리를 사용 하 여 발음, 조건 샘플, 피하 종이 완전히 더 럽 히 고 얇은 샘플에 대 한 대체 방법을 제공 하는 걸을 곳을 알아내는-EM. 그것은 크게 샘플 소비를 감소 하 고 전체 샘플 준비에 사용자 제어를 향상. 또한, 메서드 수 소설 실험적인 응용 프로그램; "단일 셀 시각적 proteomics"22,23,,2425라는 접근 방식에서 개별 셀의 격리 된 생물 학적 구성 요소 작성 등

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Liquid handling&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcapillary tip</td><td>New Objective</td><td>FS360-100-30-N-20</td><td>SilicaTips 30 &amp;micro;m tip ID, 100 &amp;micro;m ID , pk. 20</td></tr><tr><td></td><td></td><td>FS360-150-30-N-20</td><td>SilicaTips 30 &amp;micro;m tip ID, 150 &amp;micro;m ID , pk. 20</td></tr><tr><td>Conductive sleeve</td><td>New Objective</td><td>CONGAS-1&amp;nbsp;</td><td>Conductive Elastomer for HV contact, 12&quot; long</td></tr><tr><td>Fused silica tubing</td><td>BGB-Analytik</td><td>TSP-150375</td><td>TSP Standard FS Tubing, 150 &amp;micro;m ID, 363 &amp;micro;m OD, 5 meter</td></tr><tr><td>PressFit Connector</td><td>BGB-Analytik</td><td>2525LD</td><td>Deact. PressFit Connector 0.25 to 0.25 mm ID, pk. 25&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Syringe 10 &amp;micro;l</td><td>BGB-Analytik</td><td>HA-80001</td><td>Hamilton 1701 LT - Luer Tip (needle not included)&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Syringe pump controller</td><td>Cetoni</td><td>A3921000093</td><td>neMESYS controller</td></tr><tr><td>Syringe pump dosing unit</td><td>Cetoni</td><td>A3921000095</td><td>neMESYS dosing unit</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Temperature control&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dew point sensor</td><td>Meltec</td><td>UFT75-AT</td><td>Humidity/Temperature sensor, dew point calculation, USB and embedded DLL</td></tr><tr><td>Temperature sensor</td><td>Sensorshop24.ch</td><td>LS7-PT1000-1.0-3L</td><td>Surface mountable temperature sensor Pt1000</td></tr><tr><td>Peltier controller</td><td>Cooltronic</td><td>TC2812&amp;nbsp;</td><td>PID temperature controller for activation of Peltier driven systems with constant voltage output</td></tr><tr><td>Peltier element</td><td>Distrelec.ch</td><td>PE-127-14-15-S</td><td>40x40 mm</td></tr><tr><td>Water-cooling block</td><td>-</td><td>-</td><td>Water cooling block for 40x40 mm peltier element, copper base</td></tr><tr><td>Water pump</td><td>Digitec.ch</td><td>294877</td><td>XSPC X20 750 Dual 5.25 Bay Reservoir Pump Black V4</td></tr><tr><td>Water heat exchanger block</td><td>-</td><td>-</td><td>Water heat exchanger block with 2 fans to cool down circulating water</td></tr><tr><td>Small water coolers</td><td>PCHC.ch</td><td>223050</td><td>Alphacool MCX ram copper edition 2 pcs</td></tr><tr><td>Small peltier elements</td><td>Distrelec.ch</td><td>PE-031-10-15-S</td><td>Laird 15x15 mm 3.4 A 8.1 W 3.8 V 74 &amp;deg;C, 2 pcs</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Mechanics&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Linear stage z-axis</td><td>Dyneos AG</td><td>M-404.2PD</td><td>High-load precision translational stage, 50 mm travel range, DC motor</td></tr><tr><td>Stage controller</td><td>Dyneos AG</td><td>C-863</td><td>Mercury Servo Controller</td></tr><tr><td>Microscope xy-axis stage</td><td>Prior Scientific</td><td>H117EIL5</td><td>Motorized stage for Zeiss Axiovert 200 inverted microscope</td></tr><tr><td>Small permanent magnets</td><td>Supermagnete</td><td>S-05-08-N</td><td>Rod magnet &amp;Oslash; 5 mm, height 8.47 mm, neodymium, N45, nickel-plated, pk. 10</td></tr><tr><td>Small electromagnet</td><td>Schramme</td><td>EG1025A02/110</td><td>Electromagnet 24V 220 N 150 N 2,5 W</td></tr><tr><td>Controller electromagnet</td><td>Conrad.ch</td><td>MST-1630.001 7</td><td>Electromagnet control PCB board</td></tr><tr><td>Solenoid hub</td><td>Distrelec.ch</td><td>HD8286-R-F-24V100%</td><td>Kuhnke Solenid Hub 30 mm 16 N 2 N 16 W</td></tr><tr><td>Mini tweezers</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>0302-M5S-PS</td><td>Dumont Type 5 mini, super thin tips</td></tr><tr><td>Various optomechanical parts</td><td>Thorlabs</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Various mechanical parts</td><td>Workshop Biozentrum, University Basel</td><td>-</td><td>Custom designed adapter plates, holders, etc. see attached CAD files</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Optics&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laser diode</td><td>Thorlabs</td><td>CPS780S</td><td>780 nm laser diode module 2.5 mW</td></tr><tr><td>Photo detector</td><td>Thorlabs</td><td>PDA100A-EC</td><td>Si Switchable Gain Detector, 320-1100 nm, 2.4 MHz BW, 100 mm2</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;EM grids&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DURASIN FILM TEM</td><td>emsdiasum.com</td><td>DTF-03523</td><td>30 nm DuraSiN&amp;trade; silicon nitride membranes for TEM, pack of 5</td></tr><tr><td>Quantifoil Cu 200 mesh R 2/1</td><td>Quantifoil Micro Tools GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quantifoil Cu 200 mesh R 1.2/1.3</td><td>Quantifoil Micro Tools GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Buffers / Neg. stain&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma</td><td>D8537&amp;nbsp;SIGMA</td><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate Buffered Saline</td></tr><tr><td>NanoVan 2%</td><td>nanoprobes.com</td><td></td><td>Negative stain vanadium based</td></tr><tr><td>NanoW 2%</td><td>nanoprobes.com</td><td></td><td>Negative stain tungsten based</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Software&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>openBEB</td><td></td><td></td><td>The openBEB 2 framework is avaible upon request, version 3 will be downloadable</td></tr><tr><td>CryoWriter control software (openBEB plugin)</td><td></td><td>Avaible upon request, extra fees for 3rd party driver software might apply.</td><td></td></tr></tbody></table>

miniaturized sample preparation for transmission electron microscopy

최근 기술적 진보 때문 cryo 전자 현미경 검사 법 (cryo-EM) 급속 하 게 원자 해상도로 단백질 복합물의 구조 분석에 대 한 표준 방법 되고있다. 그러나, 단백질 분리 기술 및 그들에 대 한 샘플 준비 방법 병목 현상 유지. 개별 단백질 입자의 비교적 적은 수 (몇 백만에 100000) 단일 입자 그들 접근, 소형된 샘플 처리 기술 및 미세 원칙 하에 의해 단백질의 고해상도 분석에 대 한 이미지 필요 가능.
소형된 종이 blotting 무료 EM 그리드 준비 방법 샘플 사전, EM 그리드 못쓰게 조화와 nanoliter-볼륨 샘플의 사용 후 처리에 대 한 제공 됩니다. 메서드를 사용 하 여 분배 시스템 하위 nanoliter 정밀 제어 액체 통풍 관 및 EM 그리드 못쓰게, 플랫폼 위에 EM 그리드 및 선택-및-다이빙-메커니즘 샘플에 대 한 상대 습도 그로 인하여 결정 격자 온도 제어 vitrification입니다. 곳을 알아내는-EM, EM 격자 온도 제어 스테이지에 배치 및 모 세관으로 발음 하는 샘플은. 모 세관 팁 격자 표면에 근접에서 위치, 그리드 샘플 로드 되 고 초과 microcapillary로 다시 발음입니다. 그 후, 샘플 영화 안정 이며이 슬 포인트를 기준으로 플랫폼 온도 오프셋에 의해 통제 하는 제어 물 증발에 의해 약간 박 형. 주어진된 시점에서 선택 식이 메커니즘 샘플 vitrification에 대 한 액체 탄 액된 EM 그리드 전송 빠르게 실행 됩니다. 또한, 샘플 컨디셔닝 방법 부정적인 얼룩 (NS) 그들에 대 한 nanoliter 크기의 샘플 볼륨을 준비 사용할 수 있습니다.
방법론 크게 샘플 소비 하 고 기존의 방법에서 사용 필터 종이 blotting 단백질, 잠재적으로 유해한 접근을 피하십시오. 또한, 필요한 샘플의 소문자 금액 수 있습니다 빠른 샘플 컨디셔닝, "시각적 proteomics,"에 대 한 단일 셀 세포 또는 정량 분석을 위한 "무손실" 총 샘플 준비와 함께 같은 새로운 실험 전략을 복잡 한 샘플입니다.

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Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

악기 및 전송 전자 현미경 검사 법에 대 한 nanoliter 크기의 샘플 볼륨의 준비를 위한 방법 제공 됩니다. 아무 종이 blotting 단계 필요, 따라서이 단백질, 크게 샘플 손실을 감소 시키고 단일 세포 lysate 시각적 proteomics에 대 한 분석을 사용에 대 한 가질 수 해로운 결과 피하는.

전송 전자 현미경 검사 법에 대 한 소형된 샘플 준비

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein ...

miniaturized-sample-preparation-for-transmission-electron-microscopy

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

19.6K 조회수.  University of Basel. 악기 및 전송 전자 현미경 검사 법에 대 한 nanoliter 크기의 샘플 볼륨의 준비를 위한 방법 제공 됩니다. 아무 종이 blotting 단계 필요, 따라서이 단백질, 크게 샘플 손실을 감소 시키고 단일 세포 lysate 시각적 proteomics에 대 한 분석을 사용에 대 한 가질 수 해로운 결과 피하는.

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A Method for Obtaining Serial Ultrathin Sections of Microorganisms in Transmission Electron Microscopy

Observing cells and cell components in three dimensions at high magnification in transmission electron microscopy requires preparing serial ultrathin sections of the specimen. Although preparing serial ultrathin sections is considered to be very difficult, it is rather easy if the proper method is used. In this paper, we show a step-by-step procedure for safely obtaining serial ultrathin sections of microorganisms. The key points of this method are: 1) to use the large part of the specimen and adjust the specimen surface and knife edge so that they are parallel to each other; 2) to cut serial sections in groups and avoid difficulty in separating sections using a pair of hair strands when retrieving a group of serial sections onto the slit grids; 3) to use a 'Section-holding loop' and avoid mixing up the order of the section groups; 4) to use a 'Water-surface-raising loop' and make sure the sections are positioned on the apex of the water and that they touch the grid first, in order to place them in the desired position on the grids; 5) to use the support film on an aluminum rack and make it easier to recover the sections on the grids and to avoid wrinkling of the support film; and 6) to use a staining tube and avoid accidentally breaking the support films with tweezers. This new method enables obtaining serial ultrathin sections without difficulty. The method makes it possible to analyze cell structures of microorganisms at high resolution in 3D, which cannot be achieved by using the automatic tape-collecting ultramicrotome method and serial block-face or focused ion beam scanning electron microscopy.

This study presents reliable and easy procedures for obtaining serial ultrathin sections of a microorganism without expensive equipment in transmission electron microscopy.

전송 전자 현미경 검사 법에서 미생물의 직렬 Ultrathin 섹션을 얻기위한 방법

Observing cells and cell components in three dimensions at high magnification in transmission electron microscopy requires preparing serial ultrathin ...

연구

공학

Sample Preparation and Experimental Design for In Situ Multi-Beam Transmission Electron Microscopy Irradiation Experiments

There is a need to understand materials exposed to overlapping extreme environments such as high temperature, radiation, or mechanical stress. When these stressors are combined there may be synergistic effects that enable unique microstructural evolution mechanisms to activate. Understanding of these mechanisms is necessary for the input and refinement of predictive models and critical for engineering of next generation materials. The basic physics and underlying mechanisms require advanced tools to be investigated. The in situ ion irradiation transmission electron microscope (I&#179;TEM) is designed to explore these principles.
To quantitatively probe the complex dynamic interactions in materials, careful preparation of samples and consideration of experimental design is required. Particular handling or preparation of samples can easily introduce damage or features that obfuscate the measurements. There is no one correct way to prepare a sample; however, many mistakes can be made. The most common errors and things to consider are highlighted within. The I&#179;TEM has many adjustable variables and a large potential experimental space, therefore it is best to design experiments with a specific scientific question or questions in mind.
Experiments have been performed on large number of sample geometries, material classes, and with many irradiation conditions. The following are a subset of examples that demonstrate unique in situ capabilities utilizing the I3TEM. Au nanoparticles prepared by drop casting have been used to investigate the effects of single ion strikes. Au thin films have been used in studies on the effects of multibeam irradiation on microstructure evolution. Zr films have been exposed to irradiation and mechanical tension to examine creep. Ag nanopillars were subjected to simultaneous high temperature, mechanical compression, and ion irradiation to study irradiation induced creep as well. These results impact fields including: structural materials, nuclear energy, energy storage, catalysis, and microelectronics in space environments.

<meta charset="utf8"></head><body>In Situ Multi-Beam Transmission Electron Microscopy Irradiation Experiments를 위한 시료 준비 및 실험 설계

Sample preparation techniques are outlined with specific considerations for in situ ion irradiation TEM experiments. Ion species, energy, and fluence are discussed with methods for how to select and compute them. Finally, procedures for conducting an experiment are described and accompanied by the representative results.

In Situ Multi-Beam Transmission Electron Microscopy Irradiation Experiments를 위한 시료 준비 및 실험 설계

There is a need to understand materials exposed to overlapping extreme environments such as high temperature, radiation, or mechanical stress. When these ...

Optimizing Sample Preparation for Cryogenic Electron Microscopy

Cryogenic electron microscopy (cryo-EM) has revolutionized structural biology by enabling the study of macromolecular structures in near-native conditions, suspended in vitreous ice. This technique allows for the high-resolution visualization of proteins and other biomolecules without the need for crystallization, offering significant insights into their function and mechanism. Recent advancements in single-particle analysis, coupled with improved computational data processing, have made cryo-EM an indispensable tool in modern structural biology. Despite its growing adoption, cryo-EM faces persistent challenges that can limit its effectiveness, particularly uneven particle distribution. This issue often leads to poor resolution and reduced accuracy in reconstructed protein structures. This article outlines a simple, practical approach to address this challenge, using the small heat-shock protein from Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5) as an example. The method optimizes sample preparation to minimize preferential adsorption, ensuring more homogeneous particle distribution and higher-quality protein cryo-EM structures. This technique offers valuable guidance for researchers aiming to overcome similar challenges in structural studies.

This protocol presents a practical method using Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5) as an example to address uneven particle distribution through sample preparation optimization, providing a reference for researchers to efficiently elucidate macromolecular structures using cryogenic electron microscopy (cryo-EM).

극저온 전자 현미경을 위한 시료 전처리 최적화

Cryogenic electron microscopy (cryo-EM) has revolutionized structural biology by enabling the study of macromolecular structures in near-native ...

생화학

Cryo-electron Microscopy Specimen Preparation By Means Of a Focused Ion Beam

Here we present a protocol used to prepare cryo-TEM samples of Aspergillus niger spores, but which can easily be adapted for any number of microorganisms or solutions. We make use of a custom built cryo-transfer station and a modified cryo-SEM preparation chamber2. The spores are taken from a culture, plunge-frozen in a liquid nitrogen slush and observed in the cryo-SEM to select a region of interest. A thin lamella is then extracted using the FIB, attached to a TEM grid and subsequently thinned to electron transparency. The grid is transferred to a cryo-TEM holder and into a TEM for high resolution studies. Thanks to the introduction of a cooled nanomanipulator tip and a cryo-transfer station, this protocol is a straightforward adaptation to cryogenic temperature of the routinely used FIB preparation of TEM samples. As such it has the advantages of requiring a small amount of modifications to existing instruments, setups and procedures; it is easy to implement; it has a broad range of applications, in principle the same as for cryo-TEM sample preparation. One limitation is that it requires skillful handling of the specimens at critical steps to avoid or minimize contaminations.

Cryo Electron Microscopes, either Scanning (SEM) or Transmission (TEM), are widely used for characterization of biological samples or other materials with a high water content1. A SEM/Focused Ion Beam (FIB) is used to identify features of interest in samples and extract a thin, electron-transparent lamella for transfer to a cryo-TEM.

집중 이온 빔의 극저온 전자 현미경 표본 준비하여 의미

Here we present a protocol used to prepare cryo-TEM samples of Aspergillus niger spores, but which can easily be adapted for any number of microorganisms ...

생물학

Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) has emerged as a valuable model system in the field of neuroscience. The application of confocal microscopy at the Drosophila NMJ enables researchers to acquire synaptic information, encompassing both quantitative data on synapse abundance and detailed insights into their morphology. However, the diffuse distribution and limited visual range of the TEM present challenges for the ultrastructural analysis. This study introduces an innovative and efficient sample preparation method that surpasses the conventional approach. The procedure begins by placing a metal mesh at the base of a flat-bottomed bottle or test tube, followed by positioning fixed larvae samples onto the mesh. An additional mesh is placed over the samples, ensuring that they are positioned between the two meshes. The fixed samples are thoroughly dehydrated and infiltrated before proceeding with the embedding procedure. Then embedding of the samples in epoxy resin is performed in a flat sheet manner, which allows for the preparation of muscles for positioning and sectioning. Benefiting from these steps, all the muscles of Drosophila larvae can be visualized under light microscopy, therey facilitating subsequent positioning and sectioning. Excess resin is removed after locating the 6th and 7th muscles of body segments A2 and A3. Serial ultra-thin sectioning of the 6th or 7th muscle is performed.

Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae

This report provides a new sample preparation procedure for visualizing neuromuscular junctions in Drosophila Larvae. This method is more effective in preventing the curling of the samples compared to the traditional method and is particularly useful for Drosophila neuromuscular junction ultrastructural analysis.

Drosophila 유충의 신경근 접합부의 투과 전자 현미경을 위한 시료 전처리 공정 최적화

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) has emerged as a valuable model system in the field of neuroscience. The application of confocal microscopy at ...

신경과학

An Alternative Approach for Sample Preparation with Low Cell Number for TEM Analysis

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, especially cells in suspension such as hematopoietic stem cells (HSCs), remains limited due to the requirement of a high cell number during sample preparation. There are a few cytospin or monolayer approaches for TEM analysis from scarce samples, but these approaches fail to get significant quantitative data from the limited number of cells. Here, an alternative and novel approach for sample preparation in TEM studies is described for rare cell populations that enables quantitative analysis.
A relatively low cell number, i.e., 10,000 HSCs, was successfully used for TEM analysis compared to the millions of cells typically used for TEM studies. In particular, Evans blue staining was performed after paraformaldehyde-glutaraldehyde (PFA-GA) fixation to visualize the tiny cell pellet, which facilitated embedding in agarose. Clusters of numerous cells were observed in ultra-thin sections. The cells had a well preserved morphology, and the ultra-structural details of the Golgi complex and several mitochondria were visible. This efficient, easy and reproducible protocol allows sample preparation from a low cell number and can be used for qualitative and quantitative TEM analysis on rare cell populations from limited biological samples.

Here, we present a protocol to prepare samples with low cell numbers for transmission electron microscopy (TEM) analysis.

TEM 분석을위한 낮은 셀 번호와 샘플 준비를위한 다른 방법

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, ...

Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It also describes an imaging method for studying the 3D structure of thick biological specimens by scanning transmission electron tomography. The sample preparation protocol is based on conventional methods in which the sample is fixed using chemical agents, treated with a heavy atom salt contrasting agent, dehydrated in a series of ethanol baths, and embedded in resin. The specific imaging conditions for observing thick samples by scanning transmission electron microscopy are then described. Sections of the sample are observed using a through-focus method involving the collection of several images at various focal planes. This enables the recovery of in-focus information at various heights throughout the sample. This particular collection pattern is performed at each tilt angle during tomography data collection. A single image is then generated, merging the in-focus information from all the different focal planes. A classic tilt-series dataset is then generated. The advantage of the method is that the tilt-series alignment and reconstruction can be performed using standard tools. The collection of through-focal images allows the reconstruction of a 3D volume that contains all of the structural details of the sample in focus.

This report describes a sample preparation protocol and specific imaging conditions for performing scanning transmission electron tomography of thick biological specimens.

주사 투과 전자 단층 촬영에 의해 준비 및 두꺼운 생물 샘플의 관측

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The contents and morphology of the secreted vesicles reflect cell behavior or physiological status, for example cell growth, migration, cleavage, and death. The exosomes&#39; role may depend highly on size, and the size of exosomes varies from 30 to 300 nm. The most widely used method for exosome imaging is negative staining, while other results are based on Cryo-Transmission Electron Microscopy, Scanning Electron Microscopy, and Atomic Force Microscopy. The typical exosome&#39;s morphology assessed through negative staining is a cup-shape, but further details are not yet clear. An exosome well-characterized through structural study is necessary particular in medical and pharmaceutical fields. Therefore, function-dependent morphology should be verified by electron microscopy techniques such as labeling a specific protein in the detailed structure of exosome. To observe detailed structure, ultrathin sectioned images and negative stained images of exosomes were compared. In this protocol, we suggest transmission electron microscopy for the imaging of exosomes including negative staining, whole mount immuno-staining, block preparation, thin section, and immuno-gold labelling.

This protocol describes the various techniques necessary for transmission electron microscopy including negative staining, ultrathin sectioning for detailed structure, and immuno-gold labelling to determine the positions of specific proteins in exosomes.

샘플 준비 및 전송 전자 현미경 검사 법에 의해 Exosomes의 영상

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...

<meta charset="utf8"></head><body>TEM을 위한 망막 오가노이드 시료 전처리에 최적화된 프로토콜

Preparing Retinal Organoid Samples for Transmission Electron Microscopy

Retinal organoids (ROs) are a three-dimensional culture system mimicking human retinal features that have differentiated from induced pluripotent stem cells (iPSCs) under specific conditions. Synapse development and maturation in ROs have been studied immunocytochemically and functionally. However, the direct evidence of the synaptic contact ultrastructure is limited, containing both special ribbon synapses and conventional chemical synapses. Transmission electron microscopy (TEM) is characterized by high resolution and a respectable history elucidating retinal development and synapse maturation in humans and various species. It is a powerful tool to explore synaptic structure in ROs and is widely used in the research field of ROs. Therefore, to better explore the structure of RO synaptic contacts at the nanoscale and obtain high-quality microscopic evidence, we developed a simple and repeatable method of RO TEM sample preparation. This paper describes the protocol, reagents used, and detailed steps, including RO fixation preparation, post fixation, embedding, and visualization.

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: TEM을 사용하여 성숙한 망막 오가노이드의 시냅스 초구조 분석

This protocol provides an optimized and elaborate preparation procedure for retinal organoid samples for transmission electron microscopy. It is suitable for applications that involve the analysis of synapses in mature retinal organoids.

투과 전자 현미경을 위한 망막 오가노이드 시료 준비

Retinal organoids (ROs) are a three-dimensional culture system mimicking human retinal features that have differentiated from induced pluripotent stem ...

전송 전자 현미경 검사 법에 대 한 소형된 샘플 준비

요약

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In Situ Multi-Beam Transmission Electron Microscopy Irradiation Experiments를 위한 시료 준비 및 실험 설계

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극저온 전자 현미경을 위한 시료 전처리 최적화

집중 이온 빔의 극저온 전자 현미경 표본 준비하여 의미

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주사 투과 전자 단층 촬영에 의해 준비 및 두꺼운 생물 샘플의 관측

샘플 준비 및 전송 전자 현미경 검사 법에 의해 Exosomes의 영상

투과 전자 현미경을 위한 망막 오가노이드 시료 준비