超超磁氧化铁纳米探针在肺外结核检测的合成、表征及应用

在全球范围内，肺外结核病诊断往往被推迟，因为它需要手术干预以确认，因为非特定的临床表现和诊断测试的不良表现。为了改进结核杆菌抗原的血清学诊断测试，我们开发了用于检测肺外结核的超顺磁氧化铁纳米蛋白。TB-SPIO 纳米蛋白由于其顺磁特性，可以低浓度提供精确的磁共振图像，而不会引起任何自身免疫反应。

TB-SPIO纳米蛋白能够定位和检测结核分枝杆菌感染。它们也可以用作 MRI 对比剂，用于检测其他疾病。在尝试协议之前，请务必仔细研究协议，因为实验的每个部分都使用特定的核心技术。

该方法的视觉演示可以帮助学生了解如何实现这个过程，特别是对于一些更复杂的实验。为准备脱硝层涂层氧化铁磁性纳米粒子，在室温下大力将5毫升脱氧核糖核糖T40与45毫克水性氯化铁六水合物和32毫克氯化铁四水合物溶液混合。快速添加 10 毫升氢氧化铵，并使用搅拌棒在室温下搅拌产生的黑色悬浮液一小时。

在搅拌孵育结束时，将溶液离心并取出集料。为了将最终的SPIO产品与未绑定的脱硝剂T40分离，将整个五毫升反应混合物装入2.5 x 33厘米的凝胶过滤色谱柱中，用0.1摩尔醋酸钠和0.15摩尔氯化钠缓冲液将德克斯特兰吸气。然后，在空隙体积中收集纯化的脱衣涂层氧化铁磁性纳米粒子，并按照标准规程，在330纳米和490纳米时检测铁和脱氧核糖核酸柱的脱硫。

为了产生SPIO结合结核分枝杆菌表面抗体，首先在室温下将SPIO-EBDE碱性溶液的10毫升与1克沙奇氢化物混合24小时，合成SPIO-EDBE-succinic氢化物。第二天，使用12，000至4，000个分子量截止分子多孔膜管，以每变化26小时改变两升蒸馏水，对溶液进行透析。上次更换后，将产生的溶液的100微升加入400微升，每毫升TB表面抗体4.5毫克，然后加入1-羟基苯二甲醇和苯并三甲醇-1-二氧三叶草磷六氟磷酸作为催化剂，在室温下搅拌24小时。

使用 PBS 作为缓冲液，通过凝胶过滤色谱将溶液与未绑定抗体分离。要确定平均粒径、形态和大小分布，请将复合分散物滴入 200 网状铜网格，并在室温下风干样品，然后加载到传输电子显微镜上，以进行 100 千伏成像。要测量纳米刺激的松弛时间值，请使用20兆赫和37摄氏度的核磁共振松弛计加减1度。

对于纳米蛋白脉冲细胞成像，首先根据标准细胞培养协议培育人类THP-1单核细胞。当细胞达到适当的激活阶段时，将1倍10对7个单核细胞进行预孵化，用1倍10到分枝杆菌BCG的第六个菌落形成单元，进行一小时。在孵育结束时，将细胞转移到一毫升微离心管中，并在每管中加入两毫摩尔的SPIO结核分枝杆菌表面抗体结合纳米蛋白，在37摄氏度和5%的二氧化碳下进行一小时的孵育。

在孵育结束时，通过离心收集细胞，并在200微升新鲜介质中重新供应颗粒。然后，使用快速梯度回声脉冲序列通过 3.0-T 磁共振成像扫描样品，以确定纳米刺激的特异性和灵敏度。要用M.bovis BCG为实验动物接种疫苗，首先在索顿的培养基中重组冻干疫苗或细菌库存，然后用盐水稀释重组的库存溶液。

接下来，将溶液的100微升装入每只动物一毫升注射器中，将全部细菌内，以热处理方式注射到每只小鼠的左背或右背肩皮中。对于活纳米探针动物体内磁共振成像，在将两个悬浮在200微升盐水中的SPIO-TB抗体探针注入每只小鼠的尾静脉之前，获取每个麻醉实验动物的T2加权快速自旋图像。然后，在注射后立即对动物进行图像，并每隔五分钟对随后 30 分钟进行一次成像。

在成像会话结束时，使用信号强度定量分析所有磁共振图像，以测量 M.tuberculosis 颗粒瘤中心与粒体区域相邻的背肌的可比位置的指定感兴趣区域。然后，使用该公式在注入对比剂之前和注射后 3 小时使用信号强度测量来计算相对信号增强。接种一个月后，从每只动物的皮内接种地点采集组织，用赤氧素和 eosin、Ziehl-Neelsen 染色用于酸性快细菌的 Ziehl-Neelsen 污渍以及用于铁铁的柏林蓝色，将正式固定石蜡嵌入 5 至 10 微米厚的组织样本。

SPIO-TB表面抗体纳米蛋白的透射电子显微镜成像显示，纳米蛋白具有分散性，平均尺寸为每核3.8正负0.4纳米。M.bovis BCG 和酸快细菌菌株可以通过 Ziehl-Neelsen 染色检测。在用含有铁铁的探针进行分离和培养后，可以通过柏林蓝色染色来识别细菌。

SPIO-TB表面抗体纳米蛋白的结核靶向程度可以通过T2加权磁共振成像确定，如在以浓度依赖的方式发生的纳米刺激存在时信号强度降低所示。在纳米注射动物中，M.tuberculosis颗粒瘤区域信号减少的T2加权增强比对照点高约14倍。感染一个月后，在纳米蛋白注射的C57黑色6小鼠中可以观察到有组织的皮下粒体瘤，这些病变中注意到新的血液血管化和淋巴细胞和上皮巨噬细胞聚集体。

阳性M.tuberculosis表达也观察到在粒状区域酸快杆菌染色阳性在病变部位。柏林蓝，铁铁阳性污渍，也可以用来确定探头对结核的敏感性。对于生命体内磁共振图像，纳米刺激注射动物在注射SPIO-TB抗体探针之前，获取每个麻醉实验动物的基线T2加权快速自旋图像。现在，我们已经建立了S单位检测肺外结核病的技术，这些抗体可以用来专门诊断肺外结核病。