我们的协议提供体内和外体测量，以可视化和描述眼睛内的海合体血管，作为研究血管回归的有用实验模型。该技术结合了活鼠体内对海洛类血管的体内纵向观察，以及活体体可视化和解剖全海样血管的精确定量。本文技术为研究持续性胎儿血管的发病机制和基本机制提供了一种实用可行的方法。
这种方法还提供了对细胞和分子机制参与调节眼血管回归的见解，这可能与其他器官的血管生成研究相关。海兰隔离步骤对初学者来说在技术上可能具有挑战性。大量的实践和耐心将有助于确保成功的解剖。
可视化此方法将提供有关该技术的详细动手信息和提示，以帮助观看者更有效地掌握技能。对于光学相干断层扫描或 OCT 成像，调整鼠标和探针，使光学神经头位于基金图像中视场的中心，并调整 OCT 成像软件中指示线的焦点和角度，在获取图像之前显示持久性海卢体血管。对于海样血管的荧光血管造影成像，稍微调整对齐方式，将视神经头置于视场中心，将显微镜滤镜更改为绿色荧光通道。
然后专注于持久性海兰类血管，并在输入后一、三、五和十分钟内获取多个图像，以确定观察容器的信号与背景比率的最佳时间点。对于外活体子宫体体解剖和可视化使用显微外科钳打开产后八天小鼠的眼睑，并在地球轨道下放置弯曲的显微手术钳，以抓住视神经，而不会挤压眼球。用钳子轻轻拉取和取出眼球，并在室温下将眼睛固定为4%的甲醛。
30分钟后，在解剖显微镜下将固定的眼球转移到冰冷的PBS上，并在四个均匀的部位将50微升明胶溶液注入眼球的玻璃体中。然后在冰上孵育眼球30分钟，在玻璃空间内凝固注射的明胶。当明胶治愈后，将眼球转移到解剖显微镜下的 PBS 培养皿上，并使用显微手术剪刀在边缘做切口以切除角膜。
在解剖显微镜下狙击并去除视神经。使用两对钳子剥离并丢弃硬膜、胆小球和视网膜色素上皮层，然后去除虹膜。视网膜的视神经侧朝上，镜片朝下，在视网膜杯下方注入50微升PBS，使PBS在明化玻璃体和视网膜之间积累。
使用显微外科钳从玻璃体中轻轻剥下视网膜杯和硅体。使用转移移液将含有浸入 PBS 中的海体组织的明胶杯转移到显微镜幻灯片。将剩余的组织翻过来，使镜头朝上。
然后抬起镜头，轻轻松开透镜图尼卡血管和血管葫风机之间的连接，然后用显微外科剪刀切割海洛外动脉，以去除镜片图尼卡血管松烷。保持平装的葫二烯杯的瓦萨海洛伊达丙烯丙酮区域。用于平装的透明体容器样品用新鲜 PBS 轻轻冲洗海轮杯，以清除任何解剖碎屑。
在 PBS 中浮动的组织使用显微外科钳来轻轻地排列和调整明胶化海体杯的位置，使杯的边缘朝下。将浸入 PBS 中的葫二度杯的幻灯片放在 37 摄氏度的滑动加热器上。明胶熔化后，葫风板扁平，在滑梯几乎干燥时将其去除，并加入一滴防褪色安装介质，用 DAPI 染色海合体中的核。
然后轻轻地将盖玻片放在葫风板上，以完成扁平安装。要成像海体容器的 DAPI 染色，请将安装的样品转移到荧光显微镜的舞台上，并确认中央海样动脉是可见的。然后识别直接从海轮动脉派生的容器分支，并手动计算容器分支的数量进行定量。
在这里，显示了三个月大的野生类型和低密度脂蛋白受体相关蛋白5或LRP5敲除小鼠（具有持久性海洛类血管的动物模型）视网膜和海合体组织的MACD图像的横截面视图。在这些基金荧光素血管造影图像的持久性催眠体血管八分支的催眠体观察在六周大的淘汰小鼠的玻璃体，而没有残余的葫风血管在野生动物类型动物的年龄。在这些透明体中扁平安装血管细胞和相关巨噬细胞可以通过其核DAPI染色来识别。
每行细胞从中央海洛氏动脉分支代表一个血管的血管。野生型小鼠在产后第8天平均有12个海兰类血管分支，而年龄匹配的LRP5敲除幼幼表现出大约25个海兰类血管分支，显示出海兰类血管的显著受损回归。此外，在LRP5敲除幼崽中也观察到延迟和不完全的视网膜血管发育。
事实上，在产后第8天，在LRP5敲除眼组织部分的横截面中仍然可以识别海样血管。而野生型的眼睛不再显示这些船只。要记住的最重要的事情是温柔和耐心时，从视网膜和其他眼组织隔离的海样系统。
隔离与不同细胞标记的海洛类血管免疫覆盖后，可以进行，以发现调节海洛体回归的细胞相互作用。该技术探讨了在眼血管生成研究中持续胎儿血管的基础细胞和分子机制。甲状甲醛、氯胺酮和西拉辛是危险的。
请使用适当的个人防护设备在化学烟罩中准备这些试剂。
