无细胞爪卵萃取物微乳液细胞周期振荡的重建

该方法有助于回答系统生物学领域中的关键问题，如线粒体网络背后的调节机制以及细胞周期时钟的动态特性和功能。该技术的主要优点是，它将生成大量具有多个细胞周期的液滴，为我们所有人提供定量操作和分析的高通量框架。首先，丢弃动物和植物杆之间界限不清的鸡蛋批次，或在动物杆顶上出现不规则的白点。

接下来，从一只雌性青蛙中选择一批合适的卵子，将卵子转移到600毫升的烧杯中。倒出多余的0.2xMMR缓冲液，并轻轻地将半胱氨酸加入1x提取物缓冲液中。之后，用手大力摇动烧杯，取出鸡蛋的果冻涂层。

重复三次，用总共800毫升的半胱氨酸缓冲液，或直到鸡蛋聚集并沉淀在烧杯的底部。去除果冻涂层后，在一升 0.2 倍 MMR 溶液中清洗鸡蛋四次。使用玻璃移液器拾取并丢弃变白的鸡蛋。

将MMR缓冲液从烧杯中倒出来，将200毫升的钙离子磷溶液加入鸡蛋中。使用玻璃移液器轻轻搅拌鸡蛋，直到它们被激活，并去除钙离子磷溶液。将鸡蛋留在钙离子磷溶液中太久会引发凋亡。

我们搅拌鸡蛋1.5分钟，并检查激活效率。如果未激活，请继续搅拌，并更频繁地检查，直到实现 90% 激活。鸡蛋在烧杯底部沉淀后，检查激活效率。

活性良好的鸡蛋有大约25%的动物杆和75%的植物杆。接下来，用总体积为50毫升的提取物缓冲液洗两次鸡蛋，并辅以蛋白酶抑制剂。然后，小心地将鸡蛋转移到0.4毫升的扣盖微管中。

在200克时将微管离心60秒，然后在600克离心30秒，以包装鸡蛋。然后，使用玻璃巴氏移液器去除鸡蛋顶部的多余的缓冲液后，每一步。之后，在15，000克的鸡蛋中，在4摄氏度下粉碎10分钟。

使用剃刀刀片切割管子，分离三层碎鸡蛋，并保持粗细胞质在中间层。然后，将粗细胞质转移到清洁超离心管。补充细胞质蛋白酶抑制剂和细胞链酶B，每毫升10微克。

将粗细胞质在15，000克和4摄氏度下离心5分钟。然后，使用剃刀刀片切割管子，并保持细胞质在中间层。将新鲜准备好的提取物放在冰上。

首先，在准备好的提取物中加入安全素-mCherry mRNA。接下来，在提取物mRNA混合物中加入200微升2%PFPE-PEG氟化物。使用涡流混合器生成液滴，根据需要调整涡流速度和持续时间。

然后，目视检查液滴，确保液滴的大小均匀。使用 200 微升移液器，将漂浮在顶部的液滴和等量的表面活性剂转移到 PCR 管中。将玻璃管浸入液滴层，等待液滴填充约 75% 的管子。

然后，将管子推入表面活性层，并完全填充管子。接下来，用矿物油填充玻璃底盘。然后，使用细钳子将充满液滴的管子浸入油中。

使用玻璃移液器清除任何可见的碎屑或泄漏的液滴。为避免液滴的移动和泄漏，应小心地将装满液滴的玻璃管浸入矿物油下面。我们可以平衡地将管子推到两端，或者先在管子的两端同时添加几滴矿物油。

在此之后，使用配备电动 xy 舞台的荧光显微镜对液滴进行成像。每六到九分钟录制一次亮场和多个荧光通道中的延时视频，直到液滴失去活动。利用这种协议，在简单、无核的细胞和具有核的复杂细胞中产生了线粒体振荡。

无核液滴在 92 小时内产生长达 30 个未采样的滴位振荡。还研究了线粒体振荡器驱动下游线粒体事件的能力。自我维持的线粒体振荡器通过不同细胞周期阶段的自主变化，推动着核形态的变化。

在尝试此过程时，重要的是要记住制作提取物时的时间，因为它对时间敏感，并且始终将鸡蛋和提取物放在冰上。该技术开发后，为系统生物学领域的研究人员探索复杂时钟特性的原理铺平了道路，如Xenopus laevis的可调性和随机性。