种系线虫与胸苷模拟教育的细胞周期分析

这种方法可以帮助回答有关C.elegans细胞周期和生殖系干细胞种群动力学的关键问题。该技术的主要优点是，它不需要转基因，它与免疫荧光染色兼容，它可以被修改为研究细胞在许多不同的条件下。当我第一次看到这种方法在Scheda实验室使用时，我非常兴奋。

虽然这种方法可以提供对C.elegans细胞周期的洞察，它也可以应用于有关老化，营养，或改变基因型的更广泛问题。一般来说，新到这种方法的实验室可能与最初的白痴脱氧核糖核酸或C.elegans赤氧林染色斗争。首先使用无菌技术，在100毫升M9缓冲液中加入200微升10毫摩尔EdU，并适当补充4毫升新鲜生长的隔夜MG 1693大肠杆菌培养。

使白痴需要EdU和胸腺素补充之间的微妙平衡。由于胸腺素的量必须足以使大肠杆菌长好，而EdU的量必须足以使坚固的屏蔽免受水平。在37摄氏度和200 RPM下不超过24小时后，使用无菌技术将培养培养在两到四个无菌的50毫升锥形管之间进行离心。

重新涂抹四毫升新鲜 M9 缓冲液，使用相同的移液器将约 8 滴标有 E Coli MG1693 溶液的 E Coli MG1693 溶液涂抹到单个室温中心 60 毫升 M9 A 护式培养皿的中心。要将EdU标记的细菌喂给线虫，使用新鲜的PBS将线虫生长培养皿中的C.Elegans洗入1.5毫升的管子中，让动物通过重力短暂沉淀。用一毫升PBS清洗动物一到两次，用玻璃巴氏移液器将线虫转移到EdU草坪中心，用一小滴PBS。

等待几分钟，让液体被吸收，并在20摄氏度下孵育至少30分钟。在孵化结束时，使用两毫升PBS将EdU培养盘上的蠕虫冲洗成玻璃解剖盘。解剖和固定线虫性腺后，冲洗一个小的毫升硅酸盐玻璃管和长玻璃巴氏移液器与PBS补充0.1%补间20，并使用移液器转移到管在少量的PBS补间。

通过离心收集性腺，并使用长而拉出的玻璃牧场移液器去除尽可能多的超凡，而不会干扰性腺颗粒。对于 EdU 检测，在性腺中加入 100 微升点击 EdU 鸡尾酒，并在室温下用实验室膜覆盖管，进行 30 到 60 分钟的孵育。在孵育结束时，用100微升的反应冲洗缓冲液清洗性腺一次，用1毫升PBS补间洗涤4次。

上次洗涤后，在样品中加入 25 微升防褪色安装介质，并辅以 DAPI。当介质在性腺上沉降时，将一个大的 2.5% 的 agarose 垫放在标准玻璃显微镜幻灯片上。然后用第二张幻灯片平展。

接下来，使用长玻璃巴氏移液器，并将所有液体和性腺放在移液器的窄尖端，以尽量减少将性腺转移到垫片时样品损失。使用粘在牙签上的睫毛，将性腺分发到糖垫上，并去除任何灰尘颗粒。然后慢慢降低一个矩形玻璃盖滑到性腺上，注意避免气泡，并去除任何多余的溶液与实验室组织。

在三维中可靠地计算细胞需要一些实践。使用斐济的单元格计数器插件和脚本（如标记单元格）删除任何重复项有助于使计数可重现。在允许盖滑在一夜之间结算后，使用细胞计数器插件和斐济手动计数每个原子核，根据磷石三个 EdU 或预基因区细胞标记的存在或不存在标记每个单独的原子核。

EdU 信号与 DAPI 信号共存。在某些核中，EdU信号覆盖所有染色体，而在其他核中，EdU信号局部化为一到两个明亮的朋克，很可能在X染色体上，在S-相较晚时复制。EdU 信号从成功的 30 分钟标记定位到预基因区大约一半的核。

虽然该技术在野生型年轻成年动物中一致有效，但相当一部分交配的5天大幼家未能在30分钟的EdU脉冲中标记。G2 的持续时间可以通过分析 M 相中 EdU 在时间过程中为正的核百分比来估计，从而允许计算 G2 的中位数和最大持续时间。G2 和 G1 的持续时间可以从 EdU 正的预基因区核的百分比进行估计，从而可以计算组合相的最大持续时间。在尝试此过程时，重要的是要记住使用同一批次的 EdU 菜，以最大限度地减少实验间变异性。

按照这个程序，其他方法，如染色与额外的抗体可以执行或回答有关细胞周期，细胞命运，或信号通路的其他问题。不要忘记，使用杀核剂模拟和副甲酸抗剂可能是危险的，并且在执行此过程时应始终采取预防措施，例如戴硝基手套。