该检测是为了解决等离子膜生物学领域关键问题，并确定受损细胞如何有效地重新密封其等离子膜。该技术可用于测量高通量容量的等离子膜再密封效率，并确定调节等离子膜再密封的特定蛋白质和相应通路。首先将20毫升的2.5倍10添加到每毫升生长介质悬浮液的第五个 HeLa 细胞，加入无菌移液器盆，并使用 10 毫升血清移液器将细胞彻底混合。
接下来，使用多通道微移子在96孔平坦、清澈、黑色聚苯乙烯组织培养的培养板中，每孔中播种100微升细胞。请记住，同质细胞分布是成功实验的关键，因为所有实验条件之间的比较都需要等效的细胞计数。在37摄氏度和5%CO2的加湿细胞培养箱中24小时后，将板读卡器预热至37摄氏度，将光学配置设置为单色器，读取模式设置为荧光，读取类型设置为动力学。
在波长设置下，选择 9 纳米激励和 15 纳米发射带通。对于使用碘化丙二的测定，将激发和发射波长分别设置为 535 纳米和 617 纳米。在板类型下，为板格式选择 96 孔，并选择与黑壁透明底板对应的预设板配置。
在读取区域下，突出显示将在整个动力学分析过程中进行分析的井。在 PMT 和光学下，将每读的闪烁预设为 6，然后选中从底部读取的框。在计时下，在 30 分钟动力学测定的总运行时间中输入零小时 30 分钟和 0 秒，并在间隔内输入零小时 5 分钟和 0 秒。
在设置信息中确认指定的设置，然后单击"确定"。然后单击"读取"以启动动能运行。若要在设置模式下设置映像参数，请为光学配置设置 MiniMax，为读取模式设置映像，为读取类型设置端点。在波长下，选择与实验激发和发射波长对应的透射光和相应的荧光盒。
将板类型和读取区域设置为刚刚演示的，并在井区设置下设置要成像的井中的站点数。在 GFP 的图像采集设置下，将设备设置为对整个井进行映像，每个图像的曝光时间为 20 毫秒。对于透光，获取每口井中心的单张图像，曝光时间为 8 毫秒。
对于碘化铀，在每口井的中心获取一个图像，曝光时间为 20 毫秒。然后确认设置信息中的设置，然后单击"确定"并读取以启动映像。为为修复允许条件设置高通量荧光检测，每井用200微升37摄氏度M1介质洗两次，在丢弃第二次洗涤后加入100微升新鲜37摄氏度M1介质，并辅以30微摩尔碘化。
对于维修限制条件，用200微升37摄氏度M2介质清洗细胞，每井补充5毫摩尔EGTA，然后用200微升的M2介质清洗。摒弃第二次洗涤后，加入100微升新鲜37摄氏度M2介质，每井补充30微摩尔碘化物。然后在透光、GFP 和 PI 下成像板，正如刚才所示。
在对板进行成像时，将 96 孔圆形底部聚丙烯微孔板放在冰上，并配置板，就像前一个板所演示的一样。为修复允许条件，添加100微升的冰冷M1介质，每井补充60微摩尔丙化碘化物，然后添加100微升的冰冷M1，或没有4X李斯特利辛O每井。对于维修限制条件，添加100微升的冰冷M2介质，每井补充60微摩尔丙二碘化物，然后添加100微升的冰冷M2，或没有4X李斯特利辛O每井。
当第一板在冰上，第二板正在准备时，在动力学测定开始前大约五分钟，在冰上以适当的实验浓度准备李斯特利辛O。当第一个板完成成像后，立即将板转移到冰上的铝箔上。五分钟后，将第二板每个孔的100微升转移到第一个冷却板中的相应井中，将移液器尖端插入每个孔溶液半月板下方，然后弹出体积，无需混合即可正确分配毒素。
让毒素与宿主细胞结合一分钟，并立即使用光谱荧光计模式将第一个板转移到板读卡器进行后动力学测定。在动力学分析结束时，立即获得板图像的后动力学成像，如动力学前成像所示。要根据核荧光确定细胞计数，在微孔板细胞枚举软件的设置下，选择重新分析，并在图像分析设置中，使用 541 选择离散对象分析作为寻找对象的波长。
在"查找对象"选项中，使用图像查找方法绘制，选择"核"，然后单击"应用"，然后单击"确定"并读取以启动单元格计数算法。GFP表达不干扰碘化钠强度测量在存在或不存在李斯特利辛O治疗。与动力学前分析相比，在动力学后成像测定中，HeLA H2B-GFP细胞中GGFP荧光强度增加，表明碘化丙二丙胺的表达可以通过GP荧光出血。
然而，重要的是，这种交叉不会影响细胞计数，因为在枚举核所涉及的分段过程不受GP荧光增加的影响。在没有李斯特利辛O的情况下，血浆膜的完整性在细胞外钙的存在或不存在时保持不变，而李斯特利辛O治疗在钙补充介质的存在下导致碘化荧光的丙酸荧光强度稳步增加。然而，在没有细胞外钙的情况下，碘化荧光的丙烯显著增加，这反映出膜重新密封的缺失。
或者，在远红色荧光的碳黄氨酸核酸结合染料可以替代碘化丙二，以尽量减少与GP的光谱重叠。此外，远红色染料的激发系数越大，信噪比越高，维修允许性与维修限制条件之间的分辨率也越高。在尝试此过程时，建议在实验前一天给所有管进行标记，因为这将为您在实验当天的所有试剂制备做好准备。
按照这个程序，其他方法，如图像细胞仪可以回答其他问题，如孔形成毒素损害所有细胞均匀或一些细胞比其他更容易。该技术开发后，为传染病和血浆膜修复领域的研究人员探索孔径对不同细胞类型的修复效率的影响铺平了道路。
