このアッセイは、原形質膜生物学の分野における重要な問題に対処し、損傷を受けた細胞が原形膜を再シールする方法を確立するために開発されました。この技術は、高スループット容量における血漿膜再封入の効率を測定し、特定のタンパク質および血漿膜再封を媒介する対応する経路を同定するために使用することができる。まず、増殖培地懸濁液1ミリリットル当たり2.5倍の10倍のHeLa細胞を無菌ピペット盆地に20ミリリットルを加え、10ミリリットルの血清ピペットを使用して細胞を完全に混合します。
次に、マルチチャネルマイクロピペットを使用して、96ウェル平らで透明な底、黒いポリスチレン組織培養処理プレートの三重でウェルあたり100マイクロリットルの細胞を播種する。すべての実験条件間の比較には同等の細胞数が必要であるため、均質な細胞分布が実験を成功させるための鍵となる点に注意してください。加湿した細胞培養インキュベーターで摂氏37度と5%CO2で24時間後、プレートリーダーを摂氏37度にプリウォームし、光学構成をモノクロメータに、読み取りモードを蛍光色に、読み取り型をキネティックに設定します。
波長設定の下で、9ナノメートル励起と15ナノメートルの発光バンドパスを選択します。ヨウ化プロピジウムを用いたアッセイの場合は、励起波長と発光波長をそれぞれ535ナノメートルと617ナノメートルに設定します。プレートタイプで、プレートフォーマットに96-ウェルを選択し、黒壁クリアボトムプレートに対応するプリセットプレート構成を選択します。
読み取り領域の下で、運動アッセイ全体で分析される井戸を強調します。PMT および光学の下で、読み取りごとの点滅を 6 に事前設定し、下から読み取るボックスをチェックします。タイミングの下で、30分の運動アッセイの合計実行時間に0時間30分0秒を入力し、間隔にゼロ時間5分0秒を入力します。
設定情報で指定した設定を確認し、[OK]をクリックします。次に、「読み取り」をクリックして、キネティック・ランを開始します。設定モード内でイメージングパラメータを設定するには、光学式設定のMiniMax、読み取りモードのイメージング、読み取りタイプのエンドポイントを設定します。波長の下で、透過光と、実験励起波長と発光波長に対応する適切な蛍光ボックスを選択します。
プレートタイプと読み取り領域をちょうど実証したように設定し、ウェルエリア設定の下で、画像化するウェル内のサイト数を設定します。GFP の画像取得設定で、イメージあたり 20 ミリ秒の露光時間でデバイス全体をイメージするように設定します。透過光の場合、8ミリ秒の露光時間で各ウェルの中心の単一の画像を取得します。
ヨウ化プロピジウムの場合、20ミリ秒の露光時間で各ウェルの中心に単一の画像を取得します。次に、設定情報の設定を確認し、[OK]をクリックして読み取り、イメージングを開始します。修復許容条件に対して高スループット蛍光ベースのアッセイを設定するには、ウェルあたり37°CM1培地の200マイクロリットルで細胞を2回洗浄し、2回目の洗浄を廃棄した後に30マイクロモルプロピジウムヨウ化物を添加した新鮮な37度のM1培地を100マイクロリットル加えます。
修復制限条件の場合、ウェルあたり5ミリモルEGTAを添加した37°C M2培地の200マイクロリットルで細胞を1回洗浄し、続いて200マイクロリットルのM2培地単独で1回洗浄します。2回目の洗浄を廃棄した後、1ウェルあたり30マイクロモルプロピジウムヨウ化物を添加した新鮮な37度摂氏M2培地100マイクロリットルを加えます。次に、光、GFP、PI の下でプレートをイメージします。
プレートがイメージされている間、氷の上に96ウェルラウンドボトムポリプロピレンマイクロプレートを置き、前のプレートのためにちょうど示したようにプレートを構成します。修復の許容条件については、1ウェルあたり60マイクロモルモルプロピジウムヨウ化物を添加した氷冷M1培地の100マイクロリットルを加え、その後、4XリステリアリシンOの有無にかかわらず100マイクロリットルの氷冷M1を添加する。修理制限条件の場合、1ウェルあたり60マイクロモルプロピジウムヨウ化物を添加した氷冷M2培地100マイクロリットルを加え、その後、4XリステリアリシンOの有無にかかわらず100マイクロリットルの氷冷M2を添加する。
プレート1が氷上にあり、プレート2が準備されている場合、運動アッセイの開始の約5分前に氷上の適切な実験濃度でリステリアリシンOを調製することが不可欠です。最初のプレートがイメージングを終了したら、すぐに氷上のアルミ箔のシートにプレートを移します。5分後、第2プレートの各ウェルから1番目の冷却プレートの適切な対応ウェルに100マイクロリットルを移し、毒素の適切な分配のために混合することなく体積を排出する前に、各ウェルに溶液の半月板の下にピペットチップを挿入する。
毒素を宿主細胞に1分間結合させ、分光フルオロメーターモードを用いて第1プレートをプレートリーダーに直ちに移して、後動態アッセイに移します。キネティックアッセイの終わりに、プレキネティックイメージングのために示されるように、プレート画像のポストキネティックイメージングを直ちに取得する。核蛍光に基づいて細胞数を決定するには、設定下のマイクロプレート細胞列挙体ソフトウェアで再分析を選択し、画像解析設定で、オブジェクトを見つけるための波長として541を使用して離散オブジェクト分析を選択します。
[オブジェクトの検索] オプションで、[画像の描画] 検索方法を使用し、[核] を選択して [適用] をクリックし、[OK] をクリックして読み取り、セルカウント アルゴリズムを開始します。GFP発現は、リステリアリシンO処理の有無においてヨウ化プロピジウム強度測定を妨げない。ヨウ化プロピジウムの発現は、運動前分析と比較して、ヒラ・H2B-GFP細胞におけるヒラ・H2B-GFP細胞におけるGFP蛍光強度の増加によって証明されるように、GFP蛍光を通して出血することができる。
しかし重要なのは、このクロスオーバーは、核の列挙に関与するセグメンテーションプロセスがGFP蛍光の増加の影響を受けないため、細胞数に影響を与えない。リステリアライシンOがない場合、細胞外カルシウムの存在下または存在しない限り、原形質膜の完全性は一定であり、カルシウム補充培地の存在下でのリステリアリシンO治療はヨウ化プロピジウム蛍光強度の着実な増加をもたらす。しかし、細胞外カルシウムがない場合、膜再密封の欠如を反映して、ヨウ化プロピジウム蛍光の有意に急激な増加がある。
あるいは、遠赤色の蛍光を有するカルボシアニン核酸結合色素を、ヨウ化プロピジウムに置換して、GFPとのスペクトル重複を最小限に抑えることができる。さらに、遠赤色色素の励起係数が大きいほど、信号対雑音比が高くなり、修復の許容条件と修復制限条件の間の解像度が向上します。この手順を試みている間、実験の日にすべての試薬の準備をするので、実験の1日前にすべてのチューブにラベルを付けることをお勧めします。
この手順に従うと、画像サイトメトリーのような他の方法は、すべての細胞を均一に損傷する細孔形成毒素を行う、または他のものよりも一部の細胞が感受性であるなどの追加の質問に答えるために行うことができる。その開発後、この技術は、感染症や原形質膜修復の分野の研究者が、異なる細胞タイプの修復効率に及ぼす孔径の影響を探求する道を開いた。
