这种方法可以帮助回答有关蛋白质在叶绿膜上传输的机制和能量，以及蛋白质在表面细胞中的位置的关键问题。该技术对胸腺蛋白靶向的主要优点是，它允许在运输过程中完全控制胸腺体的环境，包括温度、pH值、离子条件和前体浓度。首先将大约55克豌豆浸泡在400毫升蒸馏水中3小时。
将浸泡的豌豆浸泡在土壤中的塑料托盘中，上面覆盖着一层薄薄的紫土，并像文本协议中描述的那样生长9至15天。在叶绿体隔离的当天，在固定角度转子中，将 15 毫升 Percoll 和 15 毫升 2xGB 缓冲液的混合物离心，在 30，900 gs 的固定角度转子中，在 4 摄氏度下，在 4 摄氏度下将 15 毫升的 Percoll 和 15 毫升 2xGB 缓冲液离心，准备连续密度梯度。然后收获约25克9至15天大豌豆芽。
将它们添加到 95 毫升的冷 1xGB 缓冲液中，用锐化刀片。和同质化。通过至少两层奶酪布过滤这种混合物，放在冰镇烧杯的漏斗中。
在3000克的摆动桶转子中，使用15毫升聚碳酸酯离心管将滤金物离心，在4摄氏度下5分钟。丢弃上一杯，用画笔轻轻将颗粒重新装出1毫升1xGB。之后，使用玻璃姿势移液器小心地将屏幕悬挂分层在 Percoll 渐变的顶部。
在4摄氏度下，在8000克的摆动桶转子中离心10分钟，刹车关闭。使用姿势移液器再次小心地将含有完整叶绿体的下部绿带转移到一个新的 50 毫升聚碳酸酯管中，并加入 30 毫升 1xIB 缓冲液。在 1，800 gs 的摆动桶转子中将管在 4 摄氏度下离心 5 分钟。
丢弃上一杯后，用画笔轻轻将颗粒重新在1xIB的毫升中。在 1xIB 的 30 毫升中清洗，并在相同条件下再次离心。在1xIB的一毫升最后离心后重新补充颗粒。
要确定叶绿素浓度，将10微升完全重新暂停的叶绿体与5毫升80%丙酮混合。通过11微米孔径的180微米厚滤纸进行过滤，然后通过分光光度计确定叶绿素浓度。使用冷1xIB将叶绿体混合物稀释至每毫升1毫克。
在不需要频闪提取物时开始分离胸腺素，如cpTat运输，在1.5毫升管中离心完好无损的叶绿体，在4摄氏度的4摄氏度下，在1000克的摆动桶转子中，在6分钟。之后，丢弃上流剂，将颗粒重新在低氧解液缓冲液中，用微管达到每毫升1毫克。在黑暗中冰上孵育，偶尔混合10分钟。
为了恢复胸腺，在4摄氏度的摆动桶转子中离心，在4摄氏度下进行8分钟。用一到两毫升的解液缓冲液重新填充颗粒，然后在相同条件下离心两次，清洗胸腺两次。最后离心后，将颗粒重新在1xIB缓冲液的一毫升中重新下水，并使用先前证明的分光光度计确定分离胸腺中的叶绿素浓度。
对于需要频闪萃取回恢复的通路，如CPSec1和CPSP在摆动桶转子中分离的600微升叶绿体，在4摄氏度下以1000克离心6分钟。对于叶绿体解，我们用600微升的低质解液缓冲液悬浮颗粒。在黑暗中在冰上孵育10分钟，偶尔混合。
然后在3，200克的摆动桶转子中将管子离心，在4摄氏度下8分钟。为了保存频闪，将浅绿色转移到黄色上流液到新的微型离心管中，并添加相等体积的2倍粗频闪缓冲液。要清洗胸腺，在摄氏4度下加入两卷解液缓冲液，并在3，200克下离心，8分钟。
将颗粒重新在1xIB中重新浓缩，以达到每毫升1毫克的叶绿素浓度，并放在冰上，供以后用于运输测定。在42，000克的固定角度转子中，在4摄氏度下将稀释的粗频闪离离去30分钟，去除粗频闪中的残余膜。然后从每个管中收集 95% 的体积，确保不打扰黄色小颗粒，同时注意从每个管中取的体积。
要准备浓缩的频闪提取物，请将收集的超级天然物集中起来。然后使用四毫升30千吨分子量截止浓缩器浓缩提取物五倍。在冰上1.5毫升管中测定cpTat运输，将分离的胸腺酸混合到每毫升0.33毫克的最终叶绿素浓度、1xIB中准备的5毫摩尔ATP和1xIB中准备的8毫摩尔DTT。
要启动运输，请将基底蛋白引入运输组合。在室温下，以每平方米80至100微爱因斯坦/秒的光合作用活性辐射照射悬浮液，进行10分钟的反应。要停止运输反应，用冰 1xIB 稀释悬浮液八倍。
在3，200克的微型离心机中，在4摄氏度下5分钟，以回收胸腺。丢弃上清液后，将颗粒重新在120微升的冰冷1xIB中。要测定CPSec1或PSRP通路在1.5毫升的冰上管中混合以下几点。
期末叶绿素浓度为每毫升0.33毫克，每毫升叶绿素浓度为0.83毫克，在1xIB中准备5毫摩尔ATP。用冰1xIB将反应达到所需的体积，并在冰上孵育10分钟。启动运输，将基底蛋白的体积为10%的体积引入这种运输混合物。
在室温下，以每平方米80至100微爱因斯坦的光合作用活性辐射照射10分钟。为了停止反应，用冰1xIB稀释悬浮液8倍。在3，200g的微型离心机中离心，在4摄氏度下5分钟。
丢弃上清液后，将颗粒重新在120微升的冰冷1xIB中。要去除尚未运输的残留基质，在1xIB中加入6微升，每毫升热固辛2毫克，加入10毫摩尔氯化钙，消化外部蛋白质。在冰上孵育这种蛋白酶反应40分钟。
在 1xIB 中，用 25 毫摩尔 EDTA 将体积翻倍，使蛋白酶淬火。在3，200克的微型离心机中，在4摄氏度下5分钟，以回收胸腺。取出上一杯后，在1xIB中，在5毫摩尔EDTA的120微升中重新获得胸腺科伊德，并转移到一个新的1.5毫升管。
在3，200克的微型离心机中再次离心5分钟后，在4摄氏度下丢弃上流液，将颗粒重新在适当体积的莱姆利样品缓冲液中，辅以10毫摩尔EDTA。将样品放入沸水浴池中 10 分钟。继续按 SDS 页面分析示例。
iOE17蛋白质通过cpTat通路运输，导致在引入的基质和成熟加工形式之间发生2至3千吨的大小变化。这是因为n终端信号肽的裂解，表明CPTat传输成功。热解素治疗只留下成功运输，因此蛋白素耐耐成熟带。
通过CPSec1通路运输OE33前体，导致成熟基材的大小变化，以及运输基材的蛋白保护。通过cpSRP通路将LHCP前体插入胸腺膜，通过热固辛消化进行评估，导致大小变化为1.5至2千元。这表明膜插入是成功的，因为膜保护成熟的LHCP降解产物的未解，从完整的蛋白解。
看完这个视频后，你应该有一个很好的理解，如何隔离胸腺科伊德和通过能量依赖cpTat，cpSec 1和cpSRP通路检测转位。一旦掌握了这项技术，可以在三到四个小时内完成，当执行得当。虽然本视频中没有说明，但隔离和使用光合作用活性叶绿体和胸腺体时，我们通常会在实验室中关闭头顶灯。
在尝试这个程序时，重要的是保持隔离的叶绿体和胸腺体在四摄氏度。记得在开始时轻轻重新暂停叶绿体。避免在第一个离心步骤后干扰 Procoll 梯度。
此外，百分比输入样品可以与运输反应同时制备，并在同一凝胶上运行以估计基板的传输。不要忘记，使用放射性基材需要认真处理和适当的 PPE。在它的发展之后，这项技术为蛋白质靶向领域的研究人员铺平了道路，以探索能量、动力学和控制蛋白质在胸腺膜上运输的独特机制。
