이 방법은 엽록소 막을 가로지르는 단백질 수송의 메커니즘 및 에너지뿐만 아니라 플라스티드 내단백질의 위치에 관한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 틸라코이드 단백질 타겟팅을 위한 이 기술의 주요 장점은 온도, pH, 이온 조건 및 전구체 농도를 포함하여 수송 하는 동안 틸라코이드의 환경을 완벽하게 제어할 수 있다는 것입니다. 먼저 약 55그램의 완두콩을 400밀리리터의 증류수400밀리리터에 3시간 동안 담그세요.
젖은 완두콩을 토양의 플라스틱 트레이에 뿌리고, 얇은 층의 vermiculite로 덮여 있으며 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 9~15일 동안 자랍니다. 엽록소 분리 당일, 15밀리리터의 퍼콜과 15밀리리터의 2xGB 버퍼를 15밀리리터의 15밀리리터를 30, 900gs의 고정 각도 로터에서 브레이크 오프브레이크로 30분간 고정된 각도로 원심분리하여 연속 밀도 그라데이션을 준비한다. 그런 다음 9 일에서 15 일 된 완두콩 싹의 약 25 그램을 수확하십시오.
차가운 블렌더에 95밀리리터의 차가운 1xGB 버퍼에 날카로운 블레이드를 추가합니다. 그리고 균질화. 이 혼합물을 최소 2층의 치즈 천을 통해 필터링하여 차가운 비커 위에 깔때기에 놓습니다.
섭씨 4도에서 5분간 3, 000 gs의 스윙 버킷 로터에서 15밀리리터 폴리카보네이트 원심분리기 튜브를 사용하여 여과를 원심분리합니다. 상체를 버리고 페인트 브러시를 사용하여 1xGB의 1 밀리리터로 펠릿을 부드럽게 재놓습니다. 그 후 유리 자세 파이펫을 사용하여 Percoll 그라데이션 위에 화면 서스펜션을 조심스럽게 레이어링합니다.
원심분리기는 8, 000 gs의 스윙 버킷 로터에서 브레이크오프로 섭씨 4도에서 10분 동안 회전합니다. 자세 파이펫을 사용하여 손상되지 않은 엽록체를 함유한 하부 녹색 밴드를 신선한 50 밀리리터 폴리카보네이트 튜브로 조심스럽게 옮기고 1xIB 버퍼 30밀리리터를 추가합니다. 1, 800 gs에서 1, 800 gs에서 4도에서 5 분 동안 튜브를 원심 분리합니다.
상체를 폐기한 후 페인트 브러시로 1xIB의 1밀리리터로 펠릿을 부드럽게 재놓습니다. 동일한 조건에서 다시 1xIB 및 원심분리기의 30 밀리리터로 세척하십시오. 1xIB의 1 밀리리터에서 최종 원심 분리 후 펠릿을 다시 중단합니다.
엽록소 농도를 확인하려면 완전히 재중단된 엽록소 10개에 80%아세톤의 5밀리리터를 섞습니다. 11 마이크로미터 모공 크기의 180 마이크로미터 두께의 필터 용지를 통과한 다음 분광광계에 의해 엽록소 농도를 결정합니다. 엽록소 혼합물을 냉감기 1xIB를 사용하여 밀리리터당 1밀리그램으로 희석합니다.
기질 추출물이 필요하지 않을 때 틸라코이드를 격리하기 시작하려면 cpTat 수송, 원심분리기 는 1.5 밀리리터 튜브의 엽록소류를 6분 동안 섭씨 4도에서 1, 000 gs의 스윙 버킷 로터에서 그대로 클로로폴트합니다. 그 후, 상체를 버리고 저혈압 리시스 버퍼에서 펠릿을 다시 일시 중단하여 마이크로 피펫으로 밀리리터 당 1 밀리그램을 달성하십시오. 어둠 속에서 얼음에 배양하고 가끔 섞여 10분 간 섞어 보입니다.
틸로코이드를 복구하기 위해, 8 분 동안 섭씨 4도에서 3, 200 gs에서 스윙 버킷 로터에서 원심 분리기. 리시스 버퍼의 1 ~ 2 밀리리터로 펠릿을 다시 한 다음 동일한 조건에서 원심 분리하여 틸로코이드를 두 번 씻으십시오. 최종 원심분리 후, 펠릿을 1xIB 버퍼의 1밀리리터로 재보중단하고 이전에 입증된 바와 같이 분광광계를 사용하여 격리된 틸로코이드의 엽록소 농도를 결정한다.
CPSec1 및 CPSRP와 같은 기질 추출물 회수가 필요한 경로의 경우 4도에서 6분 동안 1, 000 gs에서 스윙 버킷 로터 및 원심분리기에서 분리된 엽록소류 600 마이크로리터를 eliquate합니다. 엽록혈성 용해의 경우, 우리는 근안 용해 버퍼의 600 마이크로 리터와 펠릿을 일시 중단합니다. 어둠 속에서 얼음에 10분 간 배양하여 가끔 섞어 버티고 있습니다.
그런 다음 3, 200 gs에서 스윙 버킷 로터에서 튜브를 섭씨 4도에서 8 분 동안 원심 분리합니다. 스트로마를 저장하려면 밝은 녹색을 노란색 상체로 새로운 마이크로 원심분리기 튜브로 옮기고 2배의 원유 기질 버퍼를 동일한 부피를 추가합니다. 틸로코이드를 세척하려면 섭씨 4도에서 8분간 3, 200 gs에 2권의 용해 완충제와 원심분리기를 추가합니다.
1xIB에서 펠릿을 다시 중단하여 밀리리터당 1밀리그램의 엽록소 농도를 달성하고 나중에 운송 측정기에서 사용하기 위해 얼음 위에 따로 둡니다. 42, 000 gs에서 고정 된 각도 로터에서 희석 된 원유 스트로마를 원심분리하여 원유 스트로마에서 잔류 멤브레인을 제거하고 섭씨 4도에서 30 분 동안. 그런 다음 각 튜브에서 가져온 볼륨을 지적하면서 작은 노란색 녹색 펠릿을 방해하지 않도록 각 튜브에서 볼륨의 95 %를 수집합니다.
농축 된 기질 추출물을 준비하려면 수집 된 수퍼 나탕을 풀. 그런 다음 4 밀리리터 30 킬로달톤 분자량 컷오프 농축기를 사용하여 추출물을 5배 농축합니다. 얼음에 1.5 밀리리터 튜브에서 cpTat 수송을 분석하려면 고립 된 틸로코이드를 밀리리터 당 0.33 밀리그램의 최종 엽록소 농도, 1xIB로 제조 된 5 밀리마일러 ATP 및 1xIB로 제조 된 8 밀리머 DTT를 혼합합니다.
수송을 개시하려면, 수송 믹스에 기판 단백질을 소개합니다. 실온에서 10분 동안 광합성 활성 방사선의 초당 평방 미터당 80~100마이크로아인슈타인으로 현탁액을 일광합성 활성 방사선으로 조명하여 반응을 수행한다. 수송 반응을 중지하려면, 얼음 차가운 1xIB로 서스펜션 8 배를 희석.
3, 200 gs의 원심분리기는 4°C에서 5분간 마이크로 원심분리기에서 틸로코이드를 회수합니다. 상체를 폐기한 후 120마이크로리터의 얼음 냉기 1xIB로 펠릿을 회수하십시오. CPSec1 또는 PSRP 경로를 분석하려면 얼음 위에 1.5 밀리리터 튜브에서 다음을 혼합한다.
틸라코이드는 밀리리터당 0.33밀리그램의 최종 엽록소 농도, 기질 추출물의 밀리리터 엽록소 등가물 당 0.83밀리그램, 1xIB로 제조된 5밀리머 ATP를 함유하고 있다. 얼음 차가운 1xIB로 원하는 볼륨까지 반응을 가져와 10 분 동안 얼음에 배양하십시오. 수송을 개시하기 위하여 는 이 수송 믹스에 기판 단백질의 부피에 의하여 10% 부피를 소개합니다.
실온에서 10분 동안 광합성 활성 방사선의 초당 80~100개의 미세아인으로 조명합니다. 반응을 중지하려면, 얼음 차가운 1xIB로 서스펜션 8 배를 희석. 섭씨 4도에서 5분 동안 마이크로 원심분리기에서 3, 200gs의 원심분리기.
상체를 폐기한 후 120마이크로리터의 얼음 냉기 1xIB로 펠릿을 회수하십시오. 수송되지 않은 잔류 기판을 제거하려면 밀리리터 열량당 2밀리그램의 6개의 마이크로리터와 1xIB에 10 밀리몰라 칼슘 염화칼슘을 추가하여 외부 단백질을 소화합니다. 40 분 동안 얼음에이 프로테아제 반응을 배양.
1xIB에서 25 밀리몰러 EDTA로 볼륨을 두 배로 늘려 프로테아제고를 담금질하십시오. 3, 200 gs의 원심분리기는 4°C에서 5분간 마이크로 원심분리기에서 틸로코이드를 회수합니다. 상체를 제거한 후, 1xIB에서 5밀리몰러 EDTA의 120 마이크로리터에서 회수된 틸로코이드를 재연하고 새로운 1.5 밀리리터 튜브로 이송한다.
섭씨 4도에서 5분 동안 마이크로 원심분리기에서 3, 200 gs에서 원심분리한 후, 상류제를 폐기하고 10밀리머EDTA로 보충된 적절한 볼륨의 라멜리 샘플 버퍼로 펠릿을 재연한다. 샘플을 끓는 수조에 10분간 놓습니다. SDS 페이지별로 샘플을 분석합니다.
cpTat 통로를 통해 iOE17 단백질의 수송은 도입된 기판과 성숙한 가공형태 사이의 2~3킬로달톤의 크기 이동을 초래했다. 이는 성공적인 cpTat 수송을 나타내는 n 단말 신호 펩티드의 분열 때문입니다. 열량 계수 처리는 성공적으로 운반되고 그러므로 proteus 저항하는 성숙한 밴드를 남깁니다.
CPSec1 통로를 통해 OE33 전구체의 수송, 성숙한 기판의 크기 이동, 및 수송기의 proteus 보호 결과. CPSRP 경로를 통해 LHCP 전구체의 삽입은 열분해 소화를 통해 평가되어 1.5~2킬로달톤의 크기 이동을 주도하였다. 이는 멤브레인이 성숙한 LHCP 분해 생성물의 아저씨를 완전한 프로테오리시스로부터 보호하므로 성공적인 멤브레인 삽입을 나타냈다.
이 비디오를 시청한 후에는 에너지 종속 cpTat, cpSec 1 및 cpSRP 경로를 통해 틸로코이드와 분석 트랜포트성을 격리하는 방법에 대한 좋은 이해를 가져야 합니다. 이 기술을 마스터하면 제대로 수행 할 때 3 ~ 4 시간 안에 수행 할 수 있습니다. 이 비디오에서 설명되지는 않지만 일반적으로 광합성 활성 엽록체 및 틸라코이드와 함께 격리하고 작업할 때 실험실에서 오버헤드 라이트를 차단합니다.
이 절차를 시도하는 동안 4 섭씨에서 고립 된 엽록소와 틸라코이드를 유지하는 것이 중요합니다. 처음에 엽록소를 부드럽게 다시 중단해야 합니다. 첫 번째 원심화 단계 후 Procoll 그라데이션을 방해하지 마십시오.
또한 퍼센트 입력 샘플은 수송 반응과 병행하여 제조하고 기판 수송을 추정하기 위해 동일한 젤에서 실행할 수 있습니다. 방사성 기판으로 작업하려면 양심적 인 취급과 적절한 PPE가 필요하다는 것을 잊지 마십시오. 개발 후, 이 기술은 단백질 표적화 분야의 연구원들이 틸라코이드 멤브레인을 가로지르는 단백질 수송을 관리하는 에너지, 운동학 및 독특한 메커니즘을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.
