利用本地绿色凝胶电泳分离菠菜类黄体蛋白配合物, 用时间相关单光子计数表征

这种方法对于回答光合作用研究领域的某些关键问题很有用，例如，使用能量连接的成分在生理上是真复杂吗？绿色凝胶和 TCSPC 协议的主要优点是，它快速而坚固。样品可以在一天中轻松处理和分析，使存储和稳定性问题减少。

虽然TCSPC可以提供我们在此研究的光合作用系统的见解，它也可以应用于其他系统，从化学到物理和生物，如研究荧光分子运动在液体，细胞，或新颖的结构图案，如单分子层和离子液体。要开始此过程，请准备文本协议中概述所需的库存溶液和绿色迷你凝胶。接下来，获取一些冰和调暗的灯光。

使用玻璃 Dounce 均质器，将菠菜叶完全均匀化，在大约 1 到 2 毫升的 TMK 缓冲液中。要创建一个简单的过滤设备，请将精细的任务擦除成两半，然后折叠成多个季度。从注射器上取下柱塞，然后将折叠的任务擦拭到注射器的底部。

将叶均质移入任务擦拭过滤器的中心，然后使用柱塞通过过滤器将均质液通过，并在 1.5 毫升离心管中收集。在5000克和4摄氏度下将同质质离心10分钟，使不溶性物质（包括胸腺膜）进行颗粒化。丢弃上流液，将颗粒重新在一毫升 TMK 缓冲液中。

要从每个样品中提取叶绿素，请取一个50微升的等分，然后转移到1.5毫升的微离心管中。加入950微升甲醇，盖上管子，并多次倒置。在10，000克下离心10分钟，对沉淀的蛋白质进行沉淀。

以叶绿素浓度测量为指导，必要时从每个样品中去除并丢弃一些体积，直到每个管中含有相同量的叶绿素。在5000克下离心10分钟，重新对胸腺膜进行组装。拆下并丢弃上一液，小心去除所有上一液，而不干扰颗粒。

首先，解冻一个等分的TMK 30%甘油洗涤剂溶液。反转几次，混合和保持溶液在冰上。加入适当体积的洗涤剂溶液溶解颗粒，最终叶绿素浓度为每毫升一毫克。

反复上下移液，同时小心避免在样品中起泡。然后，将样品放在冰上，让胸腺素样品溶解。溶解完成后，将样品在10，000克和4摄氏度下离心10分钟，对不溶性物质进行颗粒化，形成透明、深绿色的上清液。

在此之后，将15微升的溶解胸腺素中分直接加载到先前准备的1.5毫米原生凝胶的每一个井上。使用 1X 运行缓冲液，以 100 伏电压开始运行原生绿色凝胶。在运行期间将整个凝胶罐放在湿冰上，以降低电阻加热。

凝胶运行完成后，将其从电泳电池中取出，然后用蒸馏水冲洗凝胶板的运行缓冲液。从凝胶中取下顶板，然后用蒸馏水冲洗凝胶。将仍在底部玻璃板上的凝胶放在冰上;当凝胶不使用时，用塑料包装盖住，并在黑暗中保持干燥。

接下来，在准备进行 TCSPC 分析时，使用锋利的手术刀或剃刀刀片切除每个感兴趣的波段。确保切除带不包含污染带材。对于每个被分析的复合物，使用荧光光谱仪使室温荧光光谱在 600 到 800 纳米之间。

将遮蔽胶带放在幻灯片的两端，并折叠多次以创建垫片，从而允许将幻灯片牢固地固定在一起，而不会压缩之间的空间，然后将凝胶片夹在两个玻璃显微镜幻灯片之间。在玻璃滑梯边缘的凝胶片中加入少量水，以创建平滑的界面，减少信号散射。接下来，将凝胶夹夹在梁路径中，使光束通过板的开放边缘撞击凝胶片。

对于每个复合体，在荧光发射谱中定期收集 10，000 个总数据点。要分析给定复杂度的数据，首先对所收集的所有波长的每个衰减曲线的峰值高度进行规范化，然后尾部将每个衰减曲线与文本协议中概述的复合物的稳定状态荧光谱相匹配。绿色凝胶电泳的代表性结果为菠菜胸腺体分析提供了一个理想结果示例，其中可以看到许多清晰、锋利的绿色带。

车道 2 和 3 在非梯度 5%丙烯酰胺凝胶上呈现简单胸腺分离和电泳的更典型结果。车道4、5和6提供了一个不良结果的例子，由于胸腺素样品的溶解程度增加，而车道7演示了使用阿拉伯胸腺基酮代替菠菜时可以达到的结果。TCSPC 数据的数据曲线设置为同一时间寄存器后，可以规范化到相同的峰值高度，从而允许将曲线作为数据的第一次分析进行比较。

然后，不同复合物的峰值规范化衰减曲线可以在给定波长下彼此叠加，从而可以可视化复合体之间的行为差异。尾部匹配衰减曲线允许构建衰减相关光谱。如这里所见，LHCII的衰减相关光谱因缺乏动态特征而引人注目，LHCII荧光光谱的形状与信号衰减随时间而变化相同。

荧光光谱的衰变也延迟，需要100皮秒才能达到最大荧光。这表明，当荧光衰减时，能量不会在复合体内具有能量分明的颜料之间转移。然后为波段 5 复合物构造衰减相关光谱。

与LHCII相比，5波段的荧光衰变速度要快得多，在30皮秒内达到最大强度，500皮秒后衰减到初始强度的20%以下。在尝试此过程时，必须记住，对 TCSPC 数据的解释将依赖于其他生化信息，例如，通过 2 DSDS-PAGE 和西文图或质谱法来识别所研究的复合物的成分。