Este método es útil para responder a ciertas preguntas clave en el campo de la investigación de fotosíntesis como son complejos tilakoid putativos fisiológicamente complejos reales con componentes energéticamente conectados? La principal ventaja del gel verde y el protocolo TCSPC descrito aquí es que es rápido y robusto. Las muestras se pueden procesar y analizar fácilmente en un solo día, lo que hace que los problemas de almacenamiento y estabilidad sean menos preocupantes.
Aunque TCSPC puede proporcionar información sobre los sistemas fotosintéticos que hemos estudiado aquí, también se puede aplicar a otros sistemas que van desde productos químicos a través de productos físicos y biológicos, como estudios de movimiento molecular fluorescente en líquidos, células o motivos nuevos-estructurales como capas monomoleculares y líquidos iónicos. Para comenzar este procedimiento, prepare las soluciones de stock necesarias y mini geles verdes como se describe en el protocolo de texto. A continuación, obtenga un poco de hielo y atenúe las luces.
Usando un homogeneizador Dounce de vidrio, homogeneizar completamente las hojas de espinaca en aproximadamente uno a dos mililitros de tampón TMK. Para crear un dispositivo de filtrado simple, corte una delicada limpieza de tareas por la mitad y dóblela en cuartos. Retire el émbolo de una jeringa y, a continuación, empaquete la toallita de tarea plegada en la parte inferior de la jeringa.
Pipetear la hoja homogeneizar en el centro del filtro de limpieza de tareas, a continuación, utilice el émbolo para pasar el homogeneizar a través del filtro y recogerlo en un tubo centrífugo de 1,5 mililitros. Centrifugar el homogeneización a 5.000 g y cuatro grados Celsius durante 10 minutos para peletizar el material insoluble, incluidas las membranas tilakoideas. Deseche el sobrenadante y resuspender el pellet en un mililitro de tampón TMK.
Para extraer la clorofila de cada muestra, tome una alícuota de 50 microlitros y transfiérala a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Añadir 950 microlitros de metanol, tapar el tubo, y mezclar invirándolo varias veces. Centrifugar a 10.000 g durante 10 minutos para peletizar las proteínas precipitadas.
Utilizando las mediciones de concentración de clorofila como guía, retire y deseche un poco de volumen de cada muestra según sea necesario hasta que cada tubo contenga la misma cantidad total de clorofila. Centrifugar a 5.000 g durante 10 minutos para re-pellet las membranas tilakoide. Retire y deseche el sobrenadante, teniendo cuidado de quitar todo el sobrenadante sin alterar el pellet.
En primer lugar, descongelar una alícuota de solución de detergente TMK 30%glicerol. Invertir varias veces para mezclar y mantener la solución en hielo. Añadir un volumen adecuado de la solución detergente para disolver el pellet y dar lugar a una concentración final de clorofila de un miligramo por mililitro.
Pipetear hacia arriba y hacia abajo repetidamente mientras tiene cuidado de evitar la espuma en la muestra. Luego, mantenga la muestra sobre hielo para permitir que las muestras de tilakoide se solubilien. Una vez completada la solubilización, centrifuga la muestra a 10.000 g y cuatro grados centígrados durante 10 minutos para peletizar el material insoluble, lo que resulta en un sobrenadante de color verde claro y oscuro.
Después de esto, cargue 15 microlitros de sobrenadante de tilakoide solubilizado directamente en cada pozo de un gel nativo de 1,5 milímetros previamente preparado. Usando el búfer de funcionamiento 1X, comience a ejecutar el gel verde nativo a 100 voltios. Coloque todo el tanque de gel sobre hielo húmedo durante la carrera para mitigar el calentamiento resistivo.
Cuando el gel haya terminado de funcionar, retírelo de la célula de electroforesis y enjuague el tampón de funcionamiento de las placas de gel con agua destilada. Retire la placa superior del gel y luego enjuague el gel con agua destilada. Coloque el gel, que todavía está en la placa de vidrio inferior, sobre hielo;cuando el gel no esté en uso, cúbralo con una envoltura de plástico y manténgalo en la oscuridad para evitar que se seque.
A continuación, utilice un bisturí afilado o una cuchilla de afeitar para extirpar cada banda de interés cuando esté lista para continuar con el análisis de la TCSPC. Asegúrese de que la banda excómoda no contenga material de banda contaminante. Para cada complejo que se está analizando, utilice un espectrómetro fluorescente para crear un espectro fluorescente de temperatura ambiente entre 600 y 800 nanómetros.
Coloque la cinta de enmascaramiento en cada extremo de las diapositivas y dóblela varias veces para crear espaciadores, lo que permitirá que las diapositivas se sostengan juntas firmemente sin comprimir el espacio entre, luego empareje la rebanada de gel entre dos diapositivas de microscopía de vidrio. Añade una pequeña cantidad de agua a la rebanada de gel en el borde de los portaobjetos de vidrio para crear una interfaz suave que reducirá la dispersión de la señal. A continuación, sujeta el sándwich de gel en la trayectoria de la viga para que la viga golpee la rebanada de gel a través del borde abierto de las placas.
Para cada complejo, recopile 10.000 puntos de datos totales a intervalos regulares en todo el espectro de emisión de fluorescencia. Para analizar los datos de un complejo determinado, primero normalice la altura máxima de cada curva de decaimiento para todas las longitudes de onda recopiladas, luego la cola haga coincidir cada curva de decaimiento con el espectro de fluorescencia de estado estacionario del complejo como se describe en el protocolo de texto. Los resultados representativos de la electroforesis de gel verde proporcionan un ejemplo de un resultado ideal para el análisis de tilakoides de espinacas, donde una serie de bandas verdes claras y nítidas son visibles.
Los carriles 2 y 3 presentan resultados más típicos del aislamiento simple de tilakoide y electroforesis en un gel de acrilamida 5% no gradiente. Los carriles 4, 5 y 6 proporcionan un ejemplo de malos resultados debido al aumento de los grados de bajo solubilización de la muestra de tilakoide, mientras que el carril 7 demuestra los resultados que se pueden lograr cuando se utilizan tilakoidos de Arabidopsis en lugar de espinacas. Una vez que las curvas de datos de los datos TCSPC se han establecido en el mismo registro de tiempo, se pueden normalizar a la misma altura máxima, lo que permite comparar las curvas como un primer análisis de los datos.
Las curvas de decaimiento normalizadas por picos de diferentes complejos se pueden superponer entre sí en una longitud de onda determinada, lo que permite visualizar las diferencias de comportamiento entre los complejos. La cola que coincide con las curvas de descomposición permite la construcción de espectros asociados a la decadencia. Como se ve aquí, los espectros asociados a la descomposición para el LHCII son notables por la falta de características dinámicas y la forma del espectro de fluorescencia LHCII sigue siendo la misma que la señal decae con el tiempo.
La descomposición del espectro de fluorescencia también se retrasa, requiriendo 100 picosegundos para alcanzar la fluorescencia máxima. Esto sugiere que la energía no se transfiere entre pigmentos energéticamente distintos dentro del complejo a medida que la fluorescencia se descompone. A continuación, se construyen los espectros asociados a la descomposición para el complejo Band 5.
En comparación con el LHCII, la fluorescencia de la Banda 5 decae mucho más rápidamente, alcanzando la intensidad máxima en sólo 30 picosegundos y luego decayéndose a menos del 20% de la intensidad inicial después de 500 picosegundos. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que la interpretación de los datos de la TCSPC se basará en información bioquímica adicional que identifique los componentes de los complejos en estudio, por ejemplo, por 2 DSDS-PAGE y Western Blotting o espectrometría de masas.
