Этот метод полезен для ответа на некоторые ключевые вопросы в области исследований фотосинтеза, такие как такие как такие осязаемые тилакоидные комплексы физиологически реальных комплексов с энергетически связанными компонентами? Основным преимуществом описанного здесь зеленого геля и протокола TCSPC является то, что он быстрый и надежный. Образцы могут быть легко обработаны и проанализированы в течение одного дня, что делает вопросы хранения и стабильности менее озабоченность.
Хотя TCSPC может дать представление о фотосинтетических системах, которые мы изучали здесь, он также может быть применен к другим системам, начиная от химических и биологических, таких как исследования флуоресцентного молекулярного движения в жидкостях, клетках или новых структурных мотивах, таких как мономолекулярные слои и ионные жидкости. Для начала этой процедуры подготовьте необходимые фондовые решения и зеленые мини-гели, изложенные в текстовом протоколе. Далее, получить лед и тусклый свет.
Используя стеклянный гомогенизатор Dounce, полностью гомогенизируйте листья шпината примерно в один-два миллилитров буфера ТМК. Чтобы создать простое фильтрующее устройство, разрежьте тонкую задачу разтрите пополам и сложите ее в четвертинки. Снимите поршень со шприца, а затем упаковать сложенную задачу протрите в нижней части шприца.
Pipette лист гомогената в центре задачи протрите фильтр, а затем использовать поршень пройти гомогенат через фильтр и собрать его в 1,5-миллилитровую центрифугу трубки. Центрифуга гомогената при 5000 г и 4 градуса по Цельсию в течение 10 минут гранулировать нерастворимый материал, в том числе тилакоидные мембраны. Откажитесь от супернатанта и повторно посовелите гранулы в один миллилитр буфера ТМК.
Чтобы извлечь хлорофилл из каждого образца, возьмите 50-микролитр aliquot и передать его в 1,5-миллилитровую микроцентрифугную трубку. Добавьте 950 микролитров метанола, крышка трубки, и перемешать, инвертирование его несколько раз. Центрифуга при 10 000 г в течение 10 минут, чтобы гранулировать осажденные белки.
Используя измерения концентрации хлорофилла в качестве руководства, удалите и выбросьте некоторый объем из каждого образца по мере необходимости, пока каждая трубка не содержит одинаковое общее количество хлорофилла. Центрифуга при 5 000 г в течение 10 минут, чтобы повторно гранулировать тилакоидные мембраны. Удалите и отбросьте супернатант, будьте осторожны, чтобы удалить все супернатанты, не нарушая гранулы.
Во-первых, оттепель aliquot TMK 30%glycerol моющего средства решения. Переверните несколько раз, чтобы смешать и сохранить раствор на льду. Добавьте соответствующий объем раствора моющего средства, чтобы растворить гранулы и привести к окончательной концентрации хлорофилла один миллиграмм на миллилитр.
Pipette вверх и вниз неоднократно, будучи осторожным, чтобы избежать вспенивания в образце. Затем держите образец на льду, чтобы тилакоид образцов solubilize. После завершения растворимой центрифугировать образец на 10 000 г и 4 градуса по Цельсию в течение 10 минут, чтобы гранулировать нерастворимый материал, что приводит к ясному, темно-зеленому супернатанту.
После этого загрузите 15 микролитров солубилизованного тилакоида супернатанта непосредственно на каждую колодец ранее подготовленного 1,5-миллиметрового родного геля. Используя 1X работает буфер, начать работать родной зеленый гель на 100 вольт. Поместите весь гель бак на мокрый лед на время бега, чтобы смягчить резистивное нагревание.
Когда гель закончил работать, удалите его из клетки электрофорезиса и промойте бегущий буфер от гелеобразных пластин дистиллированной водой. Снимите верхнюю пластину с геля, а затем промойте гель дистиллированной водой. Поместите гель, который все еще находится на нижней стеклянной пластине, на лед; когда гель не используется, накройте его полиэтиленовой пленкой и держите его в темноте, чтобы предотвратить его высыхание.
Далее, используйте острый скальпель или лезвие бритвы, чтобы акциз каждой полосы интересов, когда готовы приступить к анализу TCSPC. Убедитесь, что вырезанная полоса не содержит загрязняющих материалов полосы. Для каждого анализируемого комплекса используйте флуоресцентный спектрометр, чтобы сделать комнатно-температурный флуоресцентный спектр от 600 до 800 нанометров.
Поместите маскировочную ленту на обоих концах слайдов и сложите ее в течение нескольких раз, чтобы создать спейсеры, что позволит слайды, которые будут проводиться вместе твердо, не сжимая пространство между ними, а затем бутерброд гель ломтик между двумя слайдами стеклянной микроскопии. Добавьте небольшое количество воды к ломтику геля на краю стеклянных слайдов, чтобы создать гладкий интерфейс, который уменьшит рассеяние сигнала. Далее, зажим гель бутерброд в луч путь так, что луч поражает гель ломтик через открытый край пластин.
Для каждого комплекса соберите 10 000 точек данных через регулярные промежутки времени по всему спектру выбросов флуоресценции. Чтобы проанализировать данные для данного комплекса, сначала нормализуйте пиковую высоту каждой кривой распада для всех собранных длин волн, затем хвост соответствует каждой кривой распада к устойчивому спектру флуоресценции состояния комплекса, как указано в текстовом протоколе. Репрезентативные результаты для зеленого геля электрофорез является примером идеального результата для анализа шпината тилакоидов, где ряд четких, острых зеленых полос видны.
Переулки 2 и 3 представляют более типичные результаты от простой изоляции тилакоида и электрофореза на недиардиенте 5%acrylamide гель. Переулки 4, 5 и 6 являются примером плохих результатов из-за повышения степени под solubilization образца thylakoid, в то время как полоса 7 демонстрирует результаты, которые могут быть достигнуты, когда Arabidopsis thylakoids используются вместо шпината. После того, как кривые данных TCSPC были установлены в тот же реестр времени, они могут быть нормализовыты до той же пиковой высоты, что позволяет сравнивать кривые в качестве первого анализа данных.
Пиковые нормализованные кривые распада из различных комплексов могут быть наложены друг на друга на данной длине волны, что позволяет визуализировать различия в поведении между комплексами. Хвост, соответствующий кривым распада, позволяет создавать спектры, связанные с распадом. Как видно здесь, связанные с распадом спектры LHCII отличается отсутствием динамических особенностей, а форма спектра флуоресценции LHCII остается такой же, как и сигнал распадается с течением времени.
Распад спектра флуоресценции также задерживается, требуя 100 пикосекунд для достижения максимальной флуоресценции. Это говорит о том, что энергия не передается между энергетически отчетливыми пигментами внутри комплекса по мере распада флуоресценции. Затем спектры, связанные с распадом, строятся для комплекса Band 5.
По сравнению с LHCII, флуоресценция от Band 5 распадается гораздо быстрее, достигая максимальной интенсивности всего за 30 пикосекунд, а затем распадается до менее чем 20% от первоначальной интенсивности после 500 пикосекунд. При попытке этой процедуры важно помнить, что интерпретация данных TCSPC будет опираться на дополнительную биохимическую информацию, идентифицяющие компоненты изучаемых комплексов, например, 2 DSDS-PAGE и Western Blotting или масс-спектрометрию.
