小鼠肾上腺的分离、固定和免疫荧光成像

免疫荧光是一种基本方法，可以帮助回答肾上腺领域有关肾上腺区、细胞特性和功能的关键问题。这项技术的主要优点是，它允许研究多种蛋白质，同时保持肾上腺组织的形态。要去除粘液肾上腺，切开周围的脂肪组织，将腺体放在含有新鲜 PBS 的 24 多井板的一个井中。

在解剖显微镜下将腺体转移到培养皿或玻璃支撑上，并使用两根 25 量针去除相邻的脂肪组织。当所有的脂肪都去除后，在4摄氏度下将组织用4%的半甲醛固定，摇动两个小时。在孵育结束时，在4摄氏度下用3个15分钟洗涤腺体，每次洗涤一至两毫升新鲜PBS。

最后一次洗涤后，在四摄氏度的两次连续乙醇浸入中脱水腺体，每次孵育摇动两小时。要准备肾上腺组织进行加工，请用纱布包裹腺体，并将肾上腺包裹在组织嵌入的盒式磁带中。然后，将盒式磁带放在装满 70% 乙醇的罐子中，储存四摄氏度，直到加工。

要处理组织，请将盒式磁带插入组织处理器中进行处理，如表中所示。在程序结束时，将盒式磁带转移到一个嵌入站，里面装满了融化的 65 度石蜡，并使用一对钳子来解包纱布。轻轻地将肾上腺转移到嵌入模具底部中心的适当位置，将融化的石蜡倒入腺体。

然后，小心地将嵌入模具移动到冷却盘上，以方便石蜡硬化。在旋转微原子进行剖切之前，先给一系列显微镜幻灯片贴上标签，然后将幻灯片放在 37 摄氏度的幻灯片加热器上。将大约 450 微升的高压处理类型一个超纯水分配到每个幻灯片上，将微原子的截面厚度设置为 5 微米。

将嵌入的组织加载到切割块上，并降低石蜡块，直到样品与微切刀边缘处于面部水平。以稳定的节奏旋转手轮，执行初始修剪以去除石蜡并暴露肾上腺组织。然后，通过肾上腺的端部获取五微米分段，使用钳子将每个部分转移到水滴中，在收集时将其转移到预先标记的幻灯片上。

通过显微镜确认部分中是否存在组织后，将热板上的幻灯片干燥约两个小时，并在 37 摄氏度的滑动托盘上至少烘烤一夜，直到看不到更多的水。干燥后，将幻灯片存放在室温下滑梯盒中。对于免疫荧光抗原检索，用两个五分钟100%二甲苯浸入将幻灯片去质，然后进行降乙醇和水浸水系列的补液。

浸入水后，将滑梯转移到金属滑架上，将滑轨放在沸腾的0.01摩尔柠檬酸盐烧杯中，放在热板上10分钟。在孵育结束时，从热板中取出烧杯，让它冷却20分钟，注意所有肾上腺部分仍然覆盖着缓冲液。当烧杯冷却后，将幻灯片转移到科普林罐中，用柔和的摇动在新鲜的 PBS 中洗涤 3 个 10 分钟。

最后一次洗涤后，小心擦拭每张幻灯片的表面，而不损坏组织部分，并使用疏水标记在每个部分周围绕一个圆圈。将幻灯片放在加湿室中，并快速向每个部分添加至少 50 微升的阻尼溶液，在室温下孵育一小时。在阻塞孵育结束时，用新鲜 PBS 将幻灯片洗三次，每次摇动五分钟，然后将幻灯片返回腔室。

接下来，将感兴趣的原抗体鸡尾酒添加到每个部分，在摄氏四度下进行过夜孵育。第二天早上，每次洗涤用三个15分钟的新鲜PBS清洗样品，并用适当的二次抗体溶液标记幻灯片，防止光线一小时。在孵化结束时，在防止光线的摇杆上用三个15分钟的洗涤洗涤样品，在上次洗涤后在室温下用DAPI标记各部分的核7分钟。

经过三个五分钟的PBS用摇摆洗涤后，沿每个样品一个盖玻璃的表面添加60微升适合免疫荧光的安装剂，然后轻轻按压每个滑动组织部分侧下到盖玻璃上，注意避免气泡。然后，将每个幻灯片平放在深色容器中，在室温下固化至少 24 小时，然后进行成像。在脂肪去除过程中，至关重要的是不要让肾上腺干涸，因为脱水会损害组织结构。

成功去除周围脂肪组织后，肾上腺应易于检测，无需额外的可见脂肪。肾上腺部分的免疫染色，如证明揭示了核类固醇因素一染色的肾上腺细胞，酪氨酸羟基酶染色的乳腺细胞，DAPI染色的非类固醇细胞的外胶囊核，并共同染色与肾上腺和乳腺细胞。尝试此过程时，重要的是要记住，鼠标前科很小，它们的位置有些变化，使得它们的检测困难。

因此，在解剖过程中要清楚地了解该区域。这些程序是研究体内肾上腺的基本技术。之后，可以执行额外的免疫污染方法，以满足特定的科学需要。

经过开发，免疫污染为生物医学领域的研究人员探索原位蛋白表达铺平了道路，这是许多学科和领域的有用工具。