微挥和荧光素-提拉美化物，用于小鼠肾上腺的多重免疫染色 – 使用来自同一宿主物种的未结合原抗体

免疫污染在生物医学研究中被广泛用于识别感兴趣的蛋白质的位置。多路复用免疫处理可以使用不同的原抗体检测同一样品上的多个靶点。这种方法的好处是使用常用的缓冲液来消除抗体交叉反应，允许使用来自同一宿主物种的两种或两种（多个未标记的原抗体）进行免疫控制。

展示这个程序的将是研究生郑索菲娅和我实验室的客座学者琼霞。在染色之前，去蜡和补水形式固定石蜡嵌入幻灯片与五分钟的浸入每个解决方案，如指示。第二次蒸馏水浸泡后，将幻灯片放入275毫升沸腾的柠檬酸钠溶液中，放在带盖子的移液器尖端盒底部，以75%功率将该箱放入700瓦的微波炉中，使用8分钟。

在治疗结束时，打开盖子，让溶液冷却到室温，然后用三个五分钟的新鲜 PBST 洗涤在科普林罐中洗涤幻灯片。要阻止任何非特异性绑定站点，在上次洗涤后，从每张幻灯片中摇动多余的 PBST，并覆盖幻灯片，并提供足够的卷适当的阻塞解决方案。在加湿室的室温下30分钟后，摇动每个幻灯片中的过量阻断溶液，并添加250微升的首批原发抗体。

为了防止样品干燥，滑梯可能覆盖着一块石蜡薄膜。在加湿室中4摄氏度下过夜孵育后，用新鲜PBST清洗幻灯片三次，每次洗涤5分钟。甩掉多余的PBST，然后用250微升的合适二次抗体溶液快速覆盖每张幻灯片，在室温下在加湿室中孵育一小时。

在孵化结束时，如所证明，在新鲜的PBST中清洗幻灯片三次，并在每张幻灯片中加入250微升新鲜准备好的石勒普他丁马萝卜过氧化物。在室温下 30 分钟后，用新鲜的 PBST 清洗幻灯片三次。然后摆脱多余的PBST，用250微升新鲜准备好的氟磷-酪酰胺溶液覆盖每张幻灯片。

一分钟后，将幻灯片淹没在新鲜的 PBST 中，然后将三次两分钟的洗涤淹没在新鲜的 PBST 中。上次洗涤后，将几滴一对一甘油对PBS溶液涂抹在各部分，通过荧光显微镜检查荧光信号是否存在。要剥离第一个抗体复合物，请将抗体标记的幻灯片放入275毫升沸腾的柠檬酸钠溶液中至少8分钟，如所证明的。

在治疗结束时，打开盖子，让溶液冷却至室温，然后用 PBST 洗三次幻灯片，每次洗涤五分钟。为了染色的第二个目标蛋白感兴趣，在阻止非特异性结合后，标记每个样品与250微升的第二主要抗体感兴趣的在四摄氏度过夜。第二天早上，每次洗涤用新鲜 PBST 洗三次，洗涤幻灯片三次，每次洗涤时用 250 微升的合适二次抗体溶液覆盖每个幻灯片，在室温下孵育一小时。

在孵化结束时，如所证明，在新鲜的PBST中清洗幻灯片三次，并在每张幻灯片中加入250微升新鲜准备好的石勒普他丁马萝卜过氧化物。为了开发感兴趣的第二个目标蛋白的信号，经过三次PBST洗涤后，用荧光光谱中与氟磷结合的酪酰胺处理幻灯片。要停止泰酰胺信号的发展，请将幻灯片淹没到 PBST 中。

然后用适当的核染料染色样品。对于荧光显微镜成像，在盖玻片中安装每个标有核染料的幻灯片，并放置一滴适当的安装介质。使用 4X 目标定位幻灯片上的组织。

切换到 10 倍目标进行成像，将曝光时间调整为 100 至 400 毫秒，光源的强度在 40 到 80% 之间。然后获取每个通道中的图像，而无需移动舞台。每个通道的图像可以合并为多路复用荧光图像。

在不剥离第一抗体染色和二次抗体染色之间，酪氨酸羟基酶的第二染色将从感兴趣的第一个目标蛋白中接收信号，从而产生假阳性酪氨酸羟基酶染色，例如在肾上腺皮质内的这个样本中。为了从第一次免疫染色中去除马萝卜过氧化物酶中的抗体交叉反应，可以进行1分钟和8分钟的微波中位剥离，从而产生干净的双重染色结果。在负对样本中未拾取任何显著信号。

在沸腾的柠檬酸盐缓冲液中剥离8分钟也足以消除肾上腺中常用的许多抗体的抗体交叉反应。然而，在某些情况下，弱误报信号仍然可检测到，微波治疗增加20分钟仍可能无法完全消除抗体交叉反应。在荧光成像过程中，在切换通道时不要移动舞台非常重要。

但是，可能需要重新调整焦点，以获得每个通道的清晰图像。对于每个通道，请务必调整曝光时间，以确保信号适当曝光，而图像中没有过度曝光的像素或区域。在染色过程中，保持滑轨从脱蜡中水分一部分非常重要，并且可以使用相同的剥离方法多次剥离幻灯片，以允许多路复用染色。