如何定量光活化荧光蛋白在大容量和活细胞中的分数

我们在这里介绍一个协议，涉及基因耦合光谱上独特的光可操作和荧光蛋白。这些内部标尺允许量化被照片激活为荧光的PAFP分数。到目前为止，还没有一种方法可以批量量化生命细胞中有多少PAFP表达的PAFP被光激活到荧光。PA-GFP和PA Cherry在活细胞中提出了光活化效率的量化，但原则上广泛适用，可用于任何实验条件下的任何光能荧光蛋白。每当使用基因编码的荧光蛋白时，表达的蛋白质的绝对数量因细胞而异，而且未知。为了标准化细胞之间的表达，我们引入了基因耦合光谱上不同的荧光蛋白的内部标尺。通过将光能度荧光蛋白的遗传信息与荧光蛋白上始终具有光谱差异的遗传信息，产生的光度蛋白内部标尺仍以未知总量表示，但以一比一的固定已知相对量表示。开始构造质粒，如随附的文本协议中所述。此外，培养在标准细胞系的透视介质使用酚红色自由版本。当准备开始实验时，使用不带酚红色的三辛来收获细胞，以减少背景花期。收获后，用生长在T 12.5细胞培养瓶中的汇合细胞培养的细胞悬浮液填充2ml移液器。将一滴加入八室玻璃滑梯的每个腔室。在标准细胞培养条件下孵育滑梯24小时。接下来，使用商业试剂按照分配器协议转染细胞。使用 Gfp 樱桃、PA-GFP 樱桃和 Gfppa 樱桃嵌合子转换细胞。然后将细胞返回培养箱，以允许蛋白质表达、折叠和成熟。转染后总共20小时后，将细胞转移到装有加湿和加热环境室预加热至37的共合体荧光显微镜的阶段