Come quantificare la frazione di proteine fluorescenti di fotoattivazione alla rinfusa e in cellule vive

Presentiamo qui un protocollo che coinvolge proteine fotoattivabili e fluorescenti geneticamente accoppiate. Questi righelli interni consentono la quantificazione della frazione PAFP che viene foto attivata per essere fluorescente. Finora non è stato disponibile alcun metodo per quantificare alla rinfusa nelle cellule vita quante delle PAFP espresse sono foto attivate per la fluorescenza. La quantificazione presentata dell'efficienza di fotoattivazione è esemplificata per PA-GFP e PA Cherry nelle cellule vive, ma in linea di principio è ampiamente applicabile e può essere utilizzata per qualsiasi proteina fluorescente fotoattivabile in qualsiasi condizione sperimentale. Ogni volta che si lavora con proteine fluorescenti geneticamente codificate, la quantità assoluta di proteine espresse varia da cellula a cellula ed è sconosciuta. Per standardizzare l'espressione tra le cellule, introduciamo righelli interni di proteine fluorescenti geneticamente accoppiate spettralmente distinte. Accoppiando le informazioni genetiche di una proteina florescente fotoattivabile a una spettralmente distinta sempre su proteine fluorescenti vengono creati righelli interni che saranno ancora espressi a una quantità totale sconosciuta ma in una quantità relativa nota fissa di uno a uno. Per iniziare a costruire i plasmidi come descritto nel protocollo di testo di accompagnamento. Inoltre, la coltura nella linea cellulare standard nel suo mezzo prospettica utilizzando la versione senza fenolo rosso. Quando sei pronto per iniziare l'esperimento, raccogli le cellule usando la triptina senza fenolo rosso per ridurre la florescenza di fondo. Dopo il raccolto, riempire una pipetta da 2 ml con la sospensione cellulare da una coltura cellulare confluente coltivata in un pallone da coltura cellulare T 12.5. Aggiungere una goccia in ogni camera di uno scivolo di vetro a otto camere. Incubare lo scivolo in condizioni standard di coltura cellulare per 24 ore. Successivamente trasfetto le celle utilizzando reagenti commerciali seguendo il protocollo distributori. Trasfetto le cellule con le chimere GFP Cherry, PA-GFP Cherry e GFPPA Cherry. Quindi riportare le cellule nell'incubatrice per consentire l'espressione proteica, la piegatura e la maturazione. Dopo un totale di 20 ore dopo la trasfezione, trasferire le cellule allo stadio di un microscopio florescente confocale dotato della camera ambientale umidificata e riscaldata preriscaldata a 37