细胞细胞接触物蛋白质-蛋白质相互作用的荧光波动光谱测定

此方法可以帮助理解细胞对细胞相互作用领域中的关键问题，例如哪些受体在细胞对细胞接触中调解粘附或识别，以及特定配体是否触发其相互作用。这种技术的主要优点是，它允许一个人直接在活细胞中研究这种相互作用，而不需要细胞固定或中断。虽然这种方法用于研究培养细胞之间的相互作用，但它也可以应用于其他系统单膜囊泡，甚至小型模型生物体。

通常，使用这种方法的个体应该通过仔细检查细胞运动和慢速信号变化来检查其样本是否足够稳定，以便在几分钟内获得。首先，在转染前一天在六孔板的至少四口井中播种适当数量的细胞。在DMEM介质中培养37摄氏度5%二氧化碳的细胞，辅以10%FBS和1%L-谷氨酰胺。

对感兴趣的蛋白质进行基本实验转染质粒，将蛋白质融合到绿色或黄色荧光蛋白和单独的井中的红色荧光蛋白中。四小时后，去除生长介质，用一毫升PBS轻轻清洗每个井，并辅以镁和钙在井边缘的PBS，以防止细胞在洗涤过程中分离。然后删除 PBS。

将大约 50 微升的 EDTA 溶液滴到每一个井中，以方便细胞分离。在37摄氏度下孵育两分钟后，缓慢地横向摇动六井板以分离细胞。接下来，向每井添加950微升的生长介质，通过上下移液几次来重新暂停细胞，从而将所有细胞从井底分离出来。

通过目视检查重新分配后是否不存在大型细胞聚合，确保细胞正确重新分配并彼此分离。将一个井的细胞溶液转移到相应的井中。通过上下移液几次轻轻混合。

然后在35毫米的玻璃底盘上播种混合细胞，在37摄氏度下培养种子细胞，在5%的二氧化碳中培养一天。在激光扫描共焦显微镜软件中设置了光路。为了避免光谱串扰选择两个单独的轨道来激发和检测mEGFP或mEYFP和mCherry或mCardinal顺序，并选择切换轨道每行。

对于检测，请为两个通道使用适当的滤波器。将含有混合细胞的盘子放在样品架上。等待 10 分钟后，以确保温度平衡并减少焦点漂移，请使用"定位"菜单中的传输灯对电池进行聚焦。

搜索彼此接触的一对红色和绿色单元格。接下来，使用"裁剪"按钮选择垂直于单元格到单元格触点的扫描路径。缩放以达到 50 到 200 纳米的像素大小，并在扫描模式下选择"线条"。

将帧大小设置为 128 x 1 像素。将扫描速度设置为允许的最大值。然后将周期设置为 10 万到 500，000。

之后，选择适当的激光功率。将探测器设置为光子计数模式。按"开始实验"开始采集。

以原始数据格式将原始数据文件导出到 RGB TIF 映像。此文件将包含一个 kymgraph，分别包含图像的通道中绿色和红色通道数据，分别为 G 和 R。接下来，使用相应的分析软件导入 TIF 文件，然后继续执行分析。

通过执行 500 到 1000 行的块的分段时间平均值来对齐线。确定每个块中的膜位置。然后将所有方块转移到相同的横向位置。

总结沿时间轴的所有对齐线，并使用高斯函数拟合平均强度轮廓。将对应于膜的像素定义为膜位置正负 2.5 西格玛内的所有像素，并汇总每行中这些像素的强度，为每个时间点获取一个荧光信号值。如果观察到照片漂白，则通过将膜荧光时间序列与双指数函数结合并应用适当的校正公式来应用漂白校正。

根据适当的方程计算自动和交叉相关函数。为了提高分析的可靠性并避免工件执行总测量的 10 到 20 个相等段的计算。检查每个分段的荧光时间序列和相关功能，并删除明显扭曲的段。

最后，平均所有非扭曲的段。在分析数据时，仔细检查每个段的强度时间序列和相关函数，以避免由于膜外围的细胞内囊泡而出现扭曲。此处显示了 HEK 293T 细胞的强度图像，该细胞表示心肌氧化碱化-mEYFP 或 mcardinal。

观察到相对交叉相关性接近零，而自相关函数显示10至20毫秒的特征衰减时间，用于在血浆膜中扩散心肌碱酰胺和mCardinal。HEK 293T细胞的sFCCS测量的交叉相关函数表示膜锚定异质质化-棕榈碱-mEYFP具有正振幅，并显示出与自相关函数相似的衰减时间。对APLP1-mEYFP和APLP1-m）表达细胞之间的细胞间对细胞对细胞接触的sFCCS测量结果为正相对交叉相关0.45。

从细胞接触的APLP1聚类测量中获得的sFCCS相关函数显示，在较大滞后时间振荡中的大衰减时间，动态显著减小。加入锌离子后，相对交叉相关增加至平均值0.8。此外，分子亮度显著增加，从小寡聚物到更大的多体体，每个细胞上由10至50个单体组成。

瞬态不稳定性可能导致具有负值或高误正交叉相关性的交叉相关函数。相应的相关函数通常与大多数段的关联函数严重偏离。作为sFCCS交叉关联数和亮度的补充方法，可用于检测蛋白质-蛋白质相互作用。

在尝试此过程时，重要的是要记住，转染细胞的混合是一个关键步骤。轻轻混合细胞，优化转染效率，增加接触中发现红细胞和绿细胞的机会。在开发后，免疫学领域的研究人员已经使用这项技术来探索免疫突触中信号分子的相互作用。