Photoactivated 형광 단백질 대량 및 라이브 셀의 일부분을 계량 하는 방법

우리는 여기에 유전적으로 결합 된 스펙트럼 고유의 사진 활성 및 형광 단백질을 포함하는 프로토콜을 제시합니다. 이러한 내부 통치자는 형광으로 활성화된 사진이 되는 PAFP 분획의 정량화를 허용합니다. 지금까지, 어떤 방법은 형광에 활성화 된 사진 표현PAFP의 얼마나 많은 생명 세포에서 대량으로 정량화 할 수 없었다. 사진 활성화 효율의 제시된 정량화는 살아있는 세포에서 PA-GFP 및 PA Cherry에 대한 예시이지만 원칙적으로 광범위하게 적용가능하며 실험 적인 조건 하에서 모든 사진 활성형 형광 단백질에 사용할 수 있습니다. 유전적으로 인코딩된 형광 단백질로 작업할 때마다 발현된 단백질의 절대양은 세포마다 다르며 알 수 없습니다. 세포 간 발현을 표준화하기 위해, 우리는 유전적으로 결합된 광등 단백질의 내부 통치자를 소개합니다. 사진 활성성 식물성 단백질의 유전정보를 형광 단백질 내부 눈금자에 항상 구별하는 것으로 결합함으로써 여전히 알려지지 않은 총양으로 표현되지만 1대 1의 고정된 상대적 양으로 발현된다. 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 플라스미드를 구성하기 시작합니다. 또한, 페놀 레드 프리 버전을 이용한 원근 매체에서 표준 세포주에서의 배양. 실험을 시작할 준비가 되면 페놀 레드없이 트립신을 사용하여 세포를 수확하여 배경 꽃을 줄입니다. 수확 후, T 12.5 세포 배양 플라스크에서 자란 컨부유한 세포 배양으로부터 세포 현탁액으로 2ml 파이펫을 채우세요. 8개의 챔버 유리 슬라이드의 각 챔버에 한 방울을 추가합니다. 24시간 동안 표준 세포 배양 조건 하에서 슬라이드를 배양합니다. 다음으로 유통 프로토콜에 따라 상용 시약을 사용하여 세포를 트랜스펙트합니다. GFP 체리, PA-GFP 체리와 GFPPA 체리 키메라와 세포를 트랜스펙트. 그런 다음 단백질 발현, 접이식 및 성숙을 허용하기 위해 세포를 인큐베이터로 되돌려 보입니다. 총 20시간 후, 가습및 가열된 환경챔버를 장착한 공초점 플로리센트 현미경의 단계로 세포를 37시간으로 미리 데워