Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no estudo das interações hospedeiro-patógeno, permitindo o exame da expressão de codificação, não codificação e RNA viral envolvida na resposta aminosa hospedeira, bem como como um patógeno pode afetar as funções biológicas do hospedeiro. A principal vantagem desta técnica é que ela apresenta um protocolo otimizado para o processamento de RNA mRNA e não codificação de bibliotecas RNAseq reduzidas de globin de uma única amostra de sangue. Demonstrando a técnica estará Sarah Anderson, uma técnica do meu laboratório.
Comece por centrifugar os tubos de sangue a 50 20 vezes G por 10 minutos em temperatura ambiente. Trabalhando em um gabinete de segurança biológica, depois de remover o supernaspe, adicione oito mililitros de água sem RNase à pelota. Feche os tubos e o vórtice da pelota até que esteja visivelmente dissolvida, depois centrifufique os tubos a 50 20 vezes G por 10 minutos à temperatura ambiente para recuperar a pelota.
Trabalhando em um armário de segurança biológica, descarte o supernasce e salve a pelota. Para isolar o RNA total, comece por tubos de 300 microliters de tampão de ligação de lise à pelota. Após o vórtice, transfira a mistura de cada tubo para um novo tubo de centrífuga de 1,5 mililitro rotulado.
Adicione 30 microliters de aditivo homogeneizante do kit de isolamento miRNA. Vórtice os tubos e coloque no gelo por 10 minutos. Trabalhando em uma capa de fumaça, remova os tubos do gelo e adicione 300 microliters do reagente de clorofórmio ácido do kit e vórtice novamente para misturar.
Depois de centrifugar a 10.000 vezes G por cinco minutos em temperatura ambiente, remova cuidadosamente a fase aquosa para um novo tubo. Com base na quantidade de recuperação aquosa da etapa anterior, adicione 1,25 vezes o volume de 100% de etanol ao phage aquoso em cada tubo e pipeta para misturar. Prepare tubos de coleta frescos contendo um cartucho de filtro para cada amostra.
Pipeta aproximadamente 675 microliters da mistura lysate-etanol no cartucho do filtro. Centrifugar brevemente a 10.000 vezes G para passar líquido através do filtro. Descarte o fluxo.
Repita a mistura de etanol-de-lise adicionando ao filtro e centrifugação até que tenha sido completamente utilizada. Adicione 700 microliters de solução de lavagem um do kit ao cartucho do filtro. Centrifugar brevemente para puxar a solução através dos filtros.
Descarte o fluxo e mantenha os mesmos cartuchos de filtro e tubos de coleta. Adicione 500 microliters de solução de lavagem dois-três para cada cartucho de filtro. Depois de centrifuging novamente, descarte o fluxo-through e repita a etapa de lavagem.
Para remover qualquer líquido residual dos cartuchos do filtro, gire-os por mais 60 segundos. Transfira os cartuchos para tubos de coleta frescos. Adicione 100 microlitadores de 95 graus Celsius de água pré-aquecido sem nuclease ao centro de cada cartucho de filtro.
Centrifugar os cartuchos por aproximadamente 20 a 30 segundos na centrífuga de mesa em velocidade máxima. Para pré-formar a hibridização com oligos de redução de globin, primeiro desnatura o RNA adicionando cada amostra extraída em um tubo de reação sem nuclease de 0,2 mililitro. Coloque os tubos em um ciclor térmico a 70 graus Celsius por dois minutos.
Depois disso, coloque imediatamente os tubos no gelo para obter a qualidade ideal do RNA. Enquanto os tubos estão esfriando, prepare 400 microliters de mistura de oligo de redução de globina de 10X e tampão de hibridização oligo de 10X em um tubo de dois mililitros. Para fazer a mistura de hibridização, adicione seis microgramas de amostra de RNA, dois microliters da mistura de oligo de redução de globina de 10X, um microliter de tampão de hibridização oligo de 10X e água livre de nuclease a um volume final de 10 microliters a cada tubo de reação de parede fina de 0,2 mililitros.
Coloque os tubos no ciclo de calor a 70 graus Celsius por dois minutos. Depois disso, coloque imediatamente os tubos no gelo. Para realizar a digestão RNase H, primeiro diluir 10X RNase H para um X RNase H com um buffer X RNase H.
Prepare a mistura de reação RNase H combinando dois microliters de tampão RNase 10X, um microliter do inibidor RNase e dois microliters de um X RNase H, e cinco microliters de água sem nuclease a um volume total de 10 microliters. Adicione 10 microliters da mistura de reação RNase H às amostras de hibridização de redução de globina e misture bem. Digerir essa reação a 37 graus Celsius por 10 minutos e depois esfriar a quatro graus Celsius.
Pare a digestão adicionando um microliter de 0,5 molar EDTA ao tubo, e transfira todo o conteúdo do tubo para um tubo fresco de 1,5 mililitro. Imediatamente depois disso, adicione 80 microliters de água livre de RNase, 350 microliters de tampão de lise, depois 250 microliters de 100% etanol a cada tubo e misture bem por pipetação. Transfira cada amostra de 700 microliter para um cartucho separado de filtro de eluição colocado em dois tubos de coleta de mililitros para coletar o fluxo.
Centrifugar por 15 segundos a 8.000 vezes G ou superior e, em seguida, descartar o fluxo-through. Coloque os mesmos cartuchos de filtro de elução em novos dois tubos de coleta de mililitros. Para lavar as membranas do cartucho do filtro, adicione 500 microliters do tampão de lavagem leve aos cartuchos do filtro e centrífuga por 15 segundos a 8.000 vezes G ou superior.
Descarte o fluxo. Em seguida, utilizando os mesmos tubos de coleta, adicione 500 microliters de 80% de etanol aos cartuchos do filtro. Centrifugar por dois minutos a 8.000 vezes G e maior.
Descarte os tubos de fluxo e coleta e salve as colunas de rotação de eluição. Coloque cada coluna de rotação de elução em um novo tubo de coleta de dois mililitros. Centrifugar a toda velocidade por cinco minutos com a tampa aberta nos cartuchos do filtro para secar as membranas da coluna de giro e evitar a transferência do etanol.
Depois de descartar os tubos de coleta, coloque cada cartucho de filtro seco em um tubo fresco de coleta de 1,5 mililitro. Adicione 14 microliters de água livre de RNase diretamente ao centro da membrana do cartucho do filtro. Para elutar o RNA, centrifugar os tubos por 60 segundos a toda velocidade e, em seguida, continuar com mais avaliação e preparação de RNA.
A amostra esgotada por globina agora pode ser dividida e usada para preparar as pequenas bibliotecas de RNA não codificadas, bem como o mRNA com esgotamento de ribo e bibliotecas de RNA longas e não codificadas. Depois de preparar bibliotecas de expressão das amostras de sangue inteiros esgotadas e esgotadas por ribo-ribo-esgotados usando este protocolo, o resumo de execução de arquivos de eletroforese mostrou uma amostra de biblioteca esgotada por globin com números de integridade de RNA que variavam de 6,3 a 9,2. Isso provou ser uma melhoria em comparação com outros estudos que utilizaram métodos de esgotamento da globina e só foram capazes de alcançar números de RIN em ou perto de seis.
A redução pré-globina e a redução pós-globina de uma única amostra de sangue suíno mostraram que as relações de concentração de 260 a 280 nanômetros estão em ou acima de duas. Usando este protocolo, foram obtidos eletroferogramas à base de chip de amostras de biblioteca de mRNA de sangue de globina e ribo-esgotadas antes da coleta e sequenciamento. Para as bibliotecas mRNA, o eletroferograma representativo tem um pico de aproximadamente 280 pares de base.
Para os pequenos eletroferogramas à base de chip ncRNAs, contêm uma gama de picos de aproximadamente 100 a 400 pares de base. Picos em aproximadamente 143 pares de base correspondem a miRNAs, e picos em aproximadamente 153 pares de base correspondem a piRNAs. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de tubos de gelo imediatamente onde observado.
Após esse procedimento, outros métodos como o sequenciamento de próxima geração devem ser realizados para responder a questões adicionais como expressão diferencial, alterações epigenéticas e seu efeito sobre vias e processos biológicos. Não se esqueça que trabalhar com reagente fenol-clorofórmio é extremamente perigoso e precauções como trabalhar em um capô de fumaça devem ser tomadas. Além disso, ao manusear sangue inteiro ou organismos infecciosos, o trabalho deve ser realizado em um gabinete de segurança biológica antes de uma ativação do organismo infeccioso.
