Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в изучении взаимодействия хозяина-патогена, позволяя изучить кодирование, некодирование и вирусное выражение РНК, участвующих в ответе на аминокислоты хозяина, а также как патоген может повлиять на биологические функции хозяина. Основным преимуществом этого метода является то, что он представляет протокол, оптимизированный для обработки мРНК и некодирующей РНК из библиотек RNAseq с пониженным глобином из одного образца крови. Демонстрация техники будет Сара Андерсон, техник из моей лаборатории.
Начните с центрифугирования труб крови при температуре 50 20 Г в течение 10 минут при комнатной температуре. Работая в кабинете биологической безопасности, после удаления супернатанта, добавьте в гранулы восемь миллилитров воды без RNase. Закройте трубки и вихрь гранулы, пока он явно растворяется, а затем центрифуги труб при 50 20 раз G в течение 10 минут при комнатной температуре, чтобы восстановить гранулы.
Работая в кабинете биологической безопасности, отбросьте супернатант и сохраните гранулы. Чтобы изолировать общую РНК, начните с трубопроводов 300 микролитров лиза, связывающих буфер с гранулами. После вихря перенесите смесь из каждой трубки в новую помеченную 1,5 миллилитровую центрифугу.
Добавьте 30 микролитров гомогенатной добавки из изоляционные комплекты miRNA. Вихрь труб и место на льду в течение 10 минут. Работая в дымовом капоте, снимите трубки со льда и добавьте 300 микролитров кислотного фенола хлороформного реагента из комплекта и вихрь снова перемешать.
После центрифугирования в 10 000 раз G в течение пяти минут при комнатной температуре, тщательно удалите aqueous фазы в новую трубку. Основываясь на количестве aqueous восстановления от предыдущего шага, добавить 1,25 раза объем 100% этанола в aqueous фага в каждой трубке и пипетки для смешивания. Подготовь свежие трубки для сбора, содержащие фильтр картридж для каждого образца.
Pipette приблизительно 675 микролитров смеси лизате-этанола на картридж фильтра. Центрифуга кратко в 10 000 раз G, чтобы пройти жидкость через фильтр. Отбросьте поток через.
Повторите лисатно-этаноловую смесь, добавляя к фильтру и центрифугации, пока она не будет полностью использована. Добавьте 700 микролитров раствора для мытья один из комплекта в картридж фильтра. Центрифуга кратко вытащить раствор через фильтры.
Откажитесь от протекаемого потока и храните те же фильтры картриджей и трубки для сбора. Добавьте 500 микролитров раствора для мытья по два-три к каждому фильтру картриджу. После центрифугирования снова, отбросить поток через и повторить шаг мытья.
Чтобы удалить остаточную жидкость из картриджей фильтра, закрутите их еще 60 секунд. Перенесите картриджи в свежие трубки сбора. Добавьте 100 микролитров 95 градусов по Цельсию, разогретых без ядра воды в центр каждого картриджа фильтра.
Центрифуга картриджей в течение примерно 20 до 30 секунд на столешнице центрифуги на максимальной скорости. Для преформизации гибридизации с глобин сокращения олиго, сначала денатурации РНК, добавив каждый извлеченный образец в 0,2 миллилитров тонкостенных нуклеазы свободной реакции трубки. Поместите трубки в тепловой циклер при 70 градусах по Цельсию в течение двух минут.
После этого немедленно поместите трубки на лед, чтобы получить оптимальное качество РНК. В то время как трубы охлаждения, подготовить 400 микролитров 10X глобина сокращения олиго смеси и 10X олиго гибридизации буфера в двух миллилитровой трубки. Чтобы сделать смесь гибридизации, добавьте шесть микрограммов образца РНК, два микролитера 10X глобина сокращения олиго смеси, один микролитр 10X олиго гибридизации буфера, и nuclease свободной воды до конечного объема 10 микролитров на каждые 0,2 миллилитров тонкостенной, нуклеазы свободной реакции трубки.
Поместите трубки в тепловой циклер при 70 градусах по Цельсию в течение двух минут. После этого сразу же поместите трубки на лед. Для выполнения RNase H пищеварения, сначала разбавить 10X RNase H до одного X RNase H с одним X RNase H буфера.
Подготовьте смесь реакции RNase H, объединив два микролитера буфера 10X RNase, один микролитер ингибитора RNase и два микролитера одного X RNase H и пять микролитров нуклеазной воды общим объемом 10 микролитров. Добавьте 10 микролитров смеси реакции RNase H в образцы гибридизации сокращения глобина и тщательно перемешайте. Переварить эту реакцию при 37 градусах по Цельсию в течение 10 минут, а затем остыть до четырех градусов по Цельсию.
Остановите пищеварение, добавив один микролитр 0,5 молярной ЭДТА в трубку, и перенесите все содержимое трубки в свежую 1,5 миллилитровую трубку. Сразу после этого добавьте 80 микролитров воды без RNase, 350 микролитров буфера лиза, затем 250 микролитров 100% этанола в каждую трубку и хорошо перемешайте с помощью трубок. Перенесите каждый образец микролитра на отдельный картридж фильтра elution, помещенный в две миллилитровые трубки для сбора протека.
Центрифуга в течение 15 секунд при 8000 раз G или больше, а затем отбросить поток через. Поместите те же картриджи фильтра elution в новые две трубки коллекции миллилитров. Чтобы промыть мембраны картриджа фильтра, добавьте 500 микролитров мягкого буфера для мытья фильтра к картриджам и центрифуге в течение 15 секунд при 8000 раз G или больше.
Отбросьте поток через. Затем, используя те же трубки сбора, добавьте 500 микролитров 80% этанола к картриджам фильтра. Центрифуга в течение двух минут при 8000 раз G и больше.
Отбросьте как протекаемые, так и коллекционые трубки, а также сохраните столбцы elution spin. Поместите каждую колонку elution spin в новую двухми миллилитровую трубку для сбора. Центрифуга на полной скорости в течение пяти минут с открытой крышкой на картриджах фильтра, чтобы высушить мембраны спиновой колонки и предотвратить перенос этанола.
После отбрасывания трубки сбора, поместите каждый высушенный картридж фильтра в свежую трубку сбора 1,5 миллилитров. Добавьте 14 микролитров воды без RNase непосредственно к центру мембраны картриджа фильтра. Чтобы утаить РНК, центрифуга труб в течение 60 секунд на полной скорости, а затем продолжить дальнейшую оценку РНК и подготовки.
Образец, исчерпанный глобином, теперь можно разделить и использовать для подготовки небольших, некодирующих РНК-библиотек, а также риборазрушаемой мРНК и длинных, некодирующих РНК библиотек. После подготовки библиотек выражения глобина истощенных и рибо истощенных целых образцов крови с помощью этого протокола, электрофорез файл запустить резюме показал глобин истощенный образец библиотеки с РНК целостности номера, которые варьировались от 6,3 до 9,2. Это оказалось улучшение по сравнению с другими исследованиями, которые использовали методы истощения глобина и были только в состоянии достичь RIN номера на уровне или около шести.
Предварительное снижение глобина и постглобин-сокращение одного свиного образца всей крови показали, что соотношение концентрации 260-280 нанометров находится на уровне или выше двух. С помощью этого протокола были получены чип-электроферограммы глобина и рибо-истощенных образцов библиотеки всей крови мРНК до объединения и секвенирования. Для библиотек мРНК репрезентативная электроферограмма имеет пик примерно в 280 базовых парах.
Для небольших ncRNAs репрезентативные чип-электроферограммы содержат диапазон пиков от примерно 100 до 400 базовых пар. Пики примерно на 143 базовых парах соответствуют миРНК, а пики примерно в 153 базовых парах соответствуют пиРНК. При попытке этой процедуры, важно помнить, чтобы ледяные трубы сразу же, где отметил.
После этой процедуры следует использовать другие методы, такие как секвенирование следующего поколения, с тем чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как дифференциальное выражение, эпигенетические изменения и их влияние на биологические пути и процессы. Не забывайте, что работа с фенол-хлороформ реагент является чрезвычайно опасным и меры предосторожности, такие как работа в дымовой капот должны быть приняты. Кроме того, при обработке всей крови или инфекционных организмов, работа должна быть выполнена в кабинете биологической безопасности до активации инфекционного организма.
