这种方法可以帮助回答荧光蛋白领域的关键问题，例如荧光蛋白如何影响它们的融合伙伴。该技术的主要优点是，它提供了荧光蛋白及其融合伙伴的影响的快速和易于扩展的评估。虽然这种方法可以提供荧光蛋白行为的见解，它也可以应用于其他基因编码标签。
同样演示这个程序的还有索尼亚·迪·格雷戈里奥，他是西方大学的研究生。通过这种方法测试的每个荧光蛋白首先被克隆成酵母表达载体，该载体编码了 FLAG 标记 HTT 的半乳糖可读版本，其中一种含有无毒 25Q 重复或亨廷顿病相关的毒性 72Q 重复。克隆通过测序进行选择和验证，随后转化为酵母。
为了准备各种测定的细胞培养，在含有酵母选择介质、葡萄糖作为碳源的果糖板上，将携带25Q或72Q标签的酵母克隆带去。同时，带25Q或72Q酵母的条纹酵母优化单体超级折叠器GP作为正对。在30摄氏度下孵育盘子两到三天。
从每个板中选择最多三个单菌落，接种五毫升合成完整介质，辅以2%葡萄糖作为碳源。在30摄氏度下孵育一夜之间。第二天，将每个隔夜培养的200微升转移到一个微离心管和离心机，以对细胞进行颗粒。
用无菌蒸馏水至少洗三次。重要的是要洗好细胞，以消除所有葡萄糖的痕迹，可能有助于抑制GAL1启动子的诱导。如先前所证明的，准备细胞，并在含有2%半乳糖的合成完整介质中重新悬浮，作为碳源，诱导聚Q融合的表达。
作为对照，在含葡萄糖的介质中重新悬浮细胞。在管旋转器中孵育细胞在30摄氏度下过夜。第二天早上，使用分光光度计测量每个培养的600纳米的光学密度。
在无菌 96 孔板中，将电池密度均衡到光学密度 600，2/100 微升合成完整介质。通过将样品的20微升从以前的井中移液到下一个井的80微升介质中，准备每个样品的四个五倍稀释。使用酵母固定工具将细胞发现到选择性板上，并在30摄氏度下孵育两天。
使用图像文档设备对板进行映像。为此测定准备细胞培养物，然后使用分光光度计测量每个培养物的 OD600。在96井板中将细胞稀释至300微升介质的OD600。
以三份三份准备每个样本。在板读卡器培养箱中孵育具有摇动功能的板。将样品数量、温度设定为30摄氏度、吸收度为600纳米、实验长度为24小时、测量间隔为15分钟。
选择连续抖动模式。实验完成后，使用科学绘图软件创建生长曲线并量化曲线下的区域。将数据粘贴到具有三个复制值的 XY 表中。
增长曲线将显示在左侧的图形文件夹下。要量化曲线下的区域，请选择左上角的分析，然后单击 XY 分析中曲线下的面积。开始这个程序，稀释生长介质中10倍的已准备好的细胞。
将每个样品的 200 微升转移到八井成像室。使用标准的宽场荧光显微镜对细胞进行成像。调整图像采集的映像设置。
由于 72Q 聚合比漫射的 25Q 信号明亮得多，因此通常需要在不同的质粒之间使用不同的采集设置，以避免荧光信号饱和。使用合适的图像处理软件处理图像。在此协议中，点印用于检查蛋白质表达水平。
在解解缓冲液中加入四微摩尔苯基硫化物和蛋白酶抑制剂鸡尾酒，为产生蛋白解酶准备缓冲液。通过离心，使每个过夜培养的五毫升。将细胞重新悬浮在200微升玻璃珠和200微升的解解缓冲液中。
漩涡 30 秒 12 轮，在两轮之间结冰。在摄氏4度下以12，000倍G离心10分钟，并收集上光。使用微滤装置在硝基纤维素膜上发现等量的总蛋白质。
用 PBS 预湿膜并组装设备。将其连接到真空源，并确保拧紧螺钉。加载样品，打开真空，让样品通过重力过滤膜。
在 PBS 05%Tween 5% 无脂肪牛奶中混合膜 30 分钟。在四摄氏度下一夜之间用原发性抗旗抗体孵育膜。第二天，用PBS 05%Tween清洗膜三次，每次10分钟。
在室温下用荧光标记的二次抗体在PBS 05%Tween 5%无脂肪牛奶中孵育膜一小时。用 PBS 05%Tween 清洗膜三次，每次 10 分钟。随后，使用氨基印迹记录系统对膜进行成像。
酵母表达 25Q 或 72Q HTT exon 一融合到酵母优化单体超级折叠器 GFP 或酵母优化单体标签 BFP2 被培养在葡萄糖或半乳糖介质过夜，或发现在阿加板或进一步孵育在液体介质。而72Q酵母优化单体超级折叠器GP诱导显著的生长缺陷。72Q酵母优化单体标签BFP2显示的生长表型类似于无毒25Q对应物，表明荧光标签的性质可以阻碍细胞中的聚Q膨胀行为。
通过荧光显微镜对荧光聚Q融合的聚合评估表明，72Q酵母优化单体超级折叠器GFP表现出显著的聚合，而72Q酵母优化的单体标签BFP2显示与无毒25Q对应体类似的扩散细胞质信号。由于各种聚Q融合的表达水平可能影响毒性，因此对点印进行点印以评估蛋白质水平。显示细胞利素五倍稀释的结果。
不要忘记，这种技术允许快速比较非字符和荧光蛋白与GP变种，但它不能直接评估寡聚化。按照这个程序，其他措施，例如，在哺乳动物细胞的溃疡测定可以回答其他问题，如荧光蛋白的单体状态。
