この方法は、蛍光タンパク質が融合パートナーにどのような影響を与えるかなど、蛍光タンパク質の分野における重要な質問に答える手助けとなります。この技術の主な利点は、蛍光タンパク質とその融合パートナーの効果を迅速かつ容易にスケーラブルに評価できることです。この方法は、蛍光タンパク質の挙動に関する洞察を提供することができますが、他の遺伝的にコードされたタグにも適用できます。
また、この手順を実証するのは、ウェスタン大学の大学院生であるソーニャ・ディ・グレゴリオです。この方法で試験される各蛍光タンパク質は、まず、無毒な25Q反復またはハンチントン病関連毒性72Q反復のいずれかを収容するFLAGタグ付きHTTエキソン1のガラクトース誘導性バージョンをコードする酵母発現ベクターにクローン化される。クローンは、シーケンシングによって選択され、検証され、その後酵母に変換されます。
各種アッセイ用の細胞培養を調製するために、炭素源としてグルコースを含む酵母選択培地を含む寒天プレート上に目的の蛍光タンパク質を有する25Qまたは72Qタグを有する酵母クローンをストリークする。同時に、25Qまたは72Q酵母を運ぶストリーク酵母は、正のコントロールとして機能するように、モノマースーパーフォルダGFPを最適化した。2~3日間、30度でプレートをインキュベートします。
各プレートから3つの単一コロニーまで選択し、炭素源として2%グルコースを添加した合成完全培地の5ミリリットルを接種する。一晩摂氏30度で培養します。翌日、各一晩培養物200マイクロリットルをマイクロ遠心チューブと遠心分離機に移して細胞をペレット化する。
滅菌蒸留水で少なくとも3回洗浄してください。GAL1プロモーターの誘導を抑え込むのに寄与する可能性のあるブドウ糖の痕跡をすべて排除するために、細胞をうまく洗うことが重要です。先に示したように細胞を調製し、ポリQ融合の発現を誘導する炭素源として2%ガラクトースを含む合成完全培地で再懸濁する。
コントロールとして、グルコース含有培地中の細胞を再懸濁する。一晩チューブ回転機で摂氏30度で細胞をインキュベートします。翌朝、分光光度計を用いて各培養液の600ナノメートルで光学濃度を測定する。
無菌96ウェルプレートで合成完全培地の100マイクロリットルの2の光学密度600に細胞密度を均等にします。前の井戸から20マイクロリットルのサンプルを次の井戸の80マイクロリットルの培地にピペット処理して、各サンプルの4つの5倍希釈液を調製します。酵母ピン留めツールを使用して、細胞を選択的プレートにスポットし、摂氏30度で2日間インキュベートします。
イメージドキュメンテーションデバイスを使用してプレートをイメージします。このアッセイ用の細胞培養物を調製し、分光光度計を用いて各培養物のOD600を測定する。96ウェルプレートの300マイクロリットルの培地で1のOD600に細胞を希釈します。
各サンプルを三重に準備します。プレートリーダーインキュベーターに揺れ機能を備えたインキュベートします。サンプル数、温度を摂氏30度、吸光度を600ナノメートル、実験の長さを24時間、測定間隔を15分に設定します。
連続揺れモードを選択します。実験が完了したら、成長曲線を作成し、科学的グラフ作成ソフトウェアを使用して曲線下の領域を定量化します。3 つのレプリケート値を持つ XY テーブルにデータを貼り付けます。
成長曲線は左側のグラフフォルダーの下に表示されます。カーブの下の領域を定量化するには、左上の解析を選択し、XY 解析で曲線の下の領域をクリックします。調製した細胞を10倍の増殖培地で希釈することにより、この手順を開始する。
各サンプルの200マイクロリットルを8ウェルイメージングチャンバーに移します。標準的な広視野蛍光顕微鏡を使用して細胞を画像化します。画像取得のイメージング設定を調整します。
72Q凝集体は拡散した25Q信号よりはるかに明るいので、蛍光シグナルの飽和を避けるために、異なるプラスミド間で異なる集録設定を使用することがしばしば必要とされる。適切な画像処理ソフトウェアを使用して画像を処理します。このプロトコルでは、ドットブロットを使用してタンパク質発現レベルを調べます。
タンパク質ライセートを生成するためのバッファーを調製し、フェニルメチルスルホニルフッ化物の4マイクロモルとプロテアーゼ阻害剤カクテルをリシスバッファーに添加します。遠心分離により一晩培養したペレットを5ミリリットルずつペレット化する。200マイクロリットルのガラスビーズと200マイクロリットルのライシスバッファーで細胞を再懸濁します。
12ラウンドで30秒間渦を起し、ラウンドの合間にアイシングします。摂氏4度で12,000倍Gで10分間遠心分離機を回収し、上清を集めます。ニトロセルロース膜上の全タンパク質の量を等しく発見するために、精密ろ過装置を使用してください。
膜をPBSで予め濡らし、装置を組み立てます。真空源に接続し、ネジが締め付けされていることを確認します。サンプルをロードし、真空をオンにし、重力によって膜を通してサンプルをフィルターさせます。
30分間、PBS 05%Tween 5%無脂肪ミルクで膜をブロットします。一次抗フラグ抗体を一晩摂氏4度で膜にインキュベートする。翌日、PBS 05%Tweenで、膜を10分間3回洗浄します。
PBS 05%Tween 5%脂肪フリーミルクを室温で1時間、蛍光標識二次抗体で膜をインキュベートします。膜をPBS 05%Tweenでそれぞれ10分間3回洗浄します。続いて、アミノブロットドキュメンテーションシステムを使用して膜を画像化します。
酵母に融合した25Qまたは72Q HTTエキソンのいずれかを発現する酵母は、酵母最適化モノマースーパーフォルダGFPまたは酵母最適化モノマータグBFP2を一晩グルコースまたはガラクトース培地で培養し、寒天プレート上で発見するか、さらに液体培地にインキュベートした。72Q酵母最適化モノマースーパーフォルダGFPは、重大な成長欠陥を誘導する一方で。72Q酵母最適化モノマータグBFP2は、蛍光タグの性質が細胞内のpolyQ拡張挙動を妨げることができることを示す非毒性25Q対応に類似した増殖表現型を表示する。
蛍光顕微鏡による蛍光ポリQ融合の凝集の評価は、72Q酵母最適化モノマースーパーフォルダGFPが有意な凝集を示し、72Q酵母最適化モノマータグBFP2は非毒性25Q対応物と同様の拡散細胞質シグナルを表示することを示している。様々なポリQ融合の発現レベルが毒性に影響を与える可能性があるため、ドットブロットはタンパク質レベルを評価するために行われた。細胞ライセートの5倍希釈からの結果が示される。
この技術は、GFP変異体との特徴のない蛍光タンパク質との迅速な比較を可能にしますが、オリゴマー化を直接評価することはできません。この手順に従って、他の手段、例えば哺乳動物細胞における潰瘍アッセイは、蛍光タンパク質の単量体状態などの追加の質問に答えるために行うことができる。
