Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen auf dem Gebiet der fluoreszierenden Proteine zu beantworten, wie z. B. wie fluoreszierende Proteine ihre Fusionspartner beeinflussen können. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine schnelle und leicht skalierbare Bewertung der Auswirkungen der fluoreszierenden Proteine und ihrer Fusionspartner ermöglicht. Obwohl diese Methode Einblicke in das fluoreszierende Proteinverhalten geben kann, kann sie auch auf andere genetisch codierte Tags angewendet werden.
Ebenfalls dieses Verfahren demonstriert Sonja Di Gregorio, Die an der Western University studiert. Jedes fluoreszierende Protein, das mit dieser Methode getestet wird, wird zuerst in einen Hefeexpressionsvektor geklont, der eine galactoseinduzierbare Version von FLAG-markiertem HTT-Exon eins kodiert, das entweder die ungiftige 25Q-Wiederholung oder die mit der Huntington-Krankheit assoziierte toxische 72Q-Wiederholung enthält. Klone werden durch Sequenzierung ausgewählt und verifiziert und anschließend in Hefe umgewandelt.
Um Zellkulturen für die verschiedenen Assays vorzubereiten, streifen Sie die Hefeklone, die 25Q oder 72Q Tag mit einem Fluoreszenzprotein von Interesse auf einer Agarplatte tragen Hefe-Auswahlmedium mit Glukose als Kohlenstoffquelle tragen. Zur gleichen Zeit, Streifenhefe tragen 25Q oder 72Q Hefe optimiert monomere Superfolder GFP als positiv zu steuern dienen. Die Platten zwei bis drei Tage bei 30 Grad Celsius bebrüten.
Wählen Sie aus jeder Platte bis zu den drei einzelnen Kolonien und impfen Sie fünf Milliliter synthetisches Komplettmedium, ergänzt mit 2% Glukose als Kohlenstoffquelle. Inkubieren Sie die Kulturen bei 30 Grad Celsius über Nacht. Am nächsten Tag 200 Mikroliter jeder Nachtkultur in ein Mikrozentrifugenrohr und eine Zentrifuge übertragen, um die Zellen zu pellet.
Mindestens dreimal mit sterilem destilliertem Wasser waschen. Es ist wichtig, die Zellen gut zu waschen, um alle Spuren von Glukose zu beseitigen, die zur Unterdrückung der Induktion des GAL1-Promotors beitragen könnten. Bereiten Sie die Zellen wie zuvor gezeigt vor und suspendieren Sie sie in einem synthetischen vollständigen Medium, das 2%Galaktose als Kohlenstoffquelle enthält, um die Expression von PolyQ-Fusionen zu induzieren.
Als Kontrolle, die Zellen in glukosehaltigen Medien wieder aussetzen. Inkubieren Sie die Zellen bei 30 Grad Celsius in einem Rohrrotator über Nacht. Messen Sie am nächsten Morgen die optische Dichte bei 600 Nanometern jeder Kultur mit einem Spektralphotometer.
Die Zelldichten auf eine optische Dichte 600 von 2 in 100 Mikroliter synthetischem Komplettmedium in einer sterilen 96-Well-Platte ausgleichen. Bereiten Sie vier fünffache Verdünnungen jeder Probe vor, indem Sie 20 Mikroliter der Probe aus dem vorherigen Brunnen in 80 Mikroliter Medien im nächsten Brunnen pipetieren. Verwenden Sie ein Hefe-Pinning-Werkzeug, um die Zellen auf selektiven Platten zu erkennen und bei 30 Grad Celsius für zwei Tage zu brüten.
Bildn die Platten mit einem Bilddokumentationsgerät. Bereiten Sie die Zellkulturen für diesen Test vor und messen Sie dann die OD600 jeder Kultur mit einem Spektralphotometer. Verdünnen Sie die Zellen auf eine OD600 von 1 in 300 Mikroliter Medien in der 96-Well-Platte.
Bereiten Sie jede Probe in dreifacher Ausfertigung vor. Inkubieren Sie die Platte in einem Plattenleser-Inkubator mit Schüttelfähigkeit. Stellen Sie die Anzahl der Proben, die Temperatur auf 30 Grad Celsius, die Absorption auf 600 Nanometer, die Länge der Experimente auf 24 Stunden und die Messintervalle auf 15 Minuten fest.
Wählen Sie den kontinuierlichen Schüttelmodus aus. Wenn das Experiment abgeschlossen ist, erstellen Sie die Wachstumskurve und quantifizieren Sie den Bereich unter der Kurve mithilfe einer wissenschaftlichen Graphik. Fügen Sie die Daten in eine XY-Tabelle mit drei Replikationswerten ein.
Die Wachstumskurve wird unter dem Diagrammordner auf der linken Seite angezeigt. Um den Bereich unter der Kurve zu quantifizieren, wählen Sie Analysieren oben links und klicken Sie in XY-Analysen auf den Bereich unter Kurve. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie die vorbereiteten Zellen 10-fach im Wachstumsmedium verdünnen.
Übertragen Sie 200 Mikroliter jeder Probe in eine achtwellige Bildkammer. Stellen Sie die Zellen mit einem Standard-Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop ab. Passen Sie die Bildeinstellungen für die Bildaufnahme an.
Da die 72Q-Aggregate viel heller sind als das diffuse 25Q-Signal, ist es häufig erforderlich, eine andere Erfassungseinstellung zwischen den verschiedenen Plasmiden zu verwenden, um eine Sättigung des fluoreszierenden Signals zu vermeiden. Verarbeiten Sie die Bilder mit einer geeigneten Bildverarbeitungssoftware. In diesem Protokoll wird Dot Blot verwendet, um die Proteinexpressionsspiegel zu untersuchen.
Bereiten Sie den Puffer für die Erzeugung von Proteinlysaten vor, indem Sie dem Lysepuffer vier Mikromolar Phenylmethylsulfonylfluorid und einen Protease-Inhibitor-Cocktail hinzufügen. Pellet fünf Milliliter jeder Nachtkultur durch Zentrifugation. Die Zellen in 200 Mikroliter Glasperlen und 200 Mikroliter Lysepuffer wieder aussetzen.
Wirbel für 30 Sekunden für 12 Runden, Vereisung zwischen den Runden. Zentrifuge bei 12.000 mal G bei vier Grad Celsius für 10 Minuten und sammeln den Überstand. Verwenden Sie ein Mikrofiltrationsgerät, um gleiche Mengen an Gesamtprotein auf einer Nitrocellulosemembran zu erkennen.
Die Membran mit PBS vorbefeuchten und das Gerät montieren. Schließen Sie es an eine Vakuumquelle an und stellen Sie sicher, dass die Schrauben angezogen sind. Laden Sie die Proben, schalten Sie das Vakuum ein und lassen Sie die Probe durch die Schwerkraft durch die Membran filtern.
Die Membran in PBS 05%Tween 5%fettfreie Milch 30 Minuten lang abschwächen. Inkubieren Sie die Membran mit primärem Anti-Flag-Antikörper bei vier Grad Celsius über Nacht. Am nächsten Tag die Membran dreimal für jeweils 10 Minuten mit PBS 05%Tween waschen.
Inkubieren Sie die Membran mit einem fluoreszierend markierten Sekundärantikörper in PBS 05%Tween 5%fettfreie Milch bei Raumtemperatur für eine Stunde. Waschen Sie die Membran dreimal für jeweils 10 Minuten mit PBS 05%Tween. Anschließend bilde die Membran mit einem Amino-Blot-Dokumentationssystem ab.
Hefe, die entweder 25Q oder 72Q HTT exon einverschmolzen, um Hefe optimiert monomere Superfolder GFP oder Hefe optimiert monomere Tag BFP2 wurde in Glukose oder Galaktose Medium über Nacht kultiviert und entweder auf Agar-Platten gesichtet oder weiter in flüssigen Medien inkubiert. Während 72Q Hefe optimiert monomere Superfolder GFP induziert einen signifikanten Wachstumsfehler. 72Q Hefe optimiert monomere Tag BFP2 zeigt einen Wachstumsphänotyp ähnlich den ungiftigen 25Q-Gegenstücken, was darauf hinweist, dass die Art des fluoreszierenden Tags das PolyQ-Expansionsverhalten in Zellen behindern kann.
Die Bewertung der Aggregation der fluoreszierenden PolyQ-Fusionen durch fluoreszierende Mikroskopie zeigt, dass 72Q Hefe optimiertmonomere Superfolder GFP signifikante Aggregation zeigt, während 72Q Hefe optimiert monomere Tag BFP2 ein diffuses zytoplasmatisches Signal ähnlich den ungiftigen 25Q-Gegenstücken zeigt. Da Expressionsniveaus der verschiedenen PolyQ-Fusionen die Toxizität beeinflussen konnten, wurden Punktflecken durchgeführt, um den Proteinspiegel zu bewerten. Gezeigt werden Ergebnisse aus fünffachen Verdünnungen der Zelllysate.
Vergessen Sie nicht, dass diese Technik einen schnellen Vergleich von nicht charakterisierten und fluoreszierenden Proteinen mit den GFP-Varianten ermöglicht, aber sie kann die Oligomerisierung nicht direkt bewerten. Nach diesem Verfahren können weitere Maßnahmen, z. B. der Geschwür-Assay in Säugetierzellen, durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie den monomeren Status der fluoreszierenden Proteine zu beantworten.
