Bu yöntem floresan proteinlerin füzyon ortaklarını nasıl etkileyebileceği gibi floresan proteinler alanında anahtar soruların yanıtlatıcı yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, floresan proteinlerin ve füzyon ortaklarının etkilerinin hızlı ve kolay ölçeklenebilir bir değerlendirmesini sağlamasıdır. Bu yöntem floresan protein davranışı içine fikir sağlayabilir rağmen, aynı zamanda diğer genetik olarak kodlanmış etiketleri uygulanabilir.
Bu prosedürü gösteren sonja Di Gregorio, Batı Üniversitesi'nde yüksek lisans öğrencisi olacak. Bu yöntemle test edilen her floresan protein ilk olarak, flag etiketli HTT eksonunun galaktoz indüklenebilir versiyonunu kodlayan bir maya ekspresyonu vektörü içine klonlanır ve toksik olmayan 25Q tekrarı veya Huntington Hastalığı ile ilişkili toksik 72Q tekrarı barındırır. Klonlar seçilir ve sıralama ile doğrulanır ve daha sonra maya dönüştürülür.
Çeşitli tahliller için hücre kültürleri hazırlamak için, karbon kaynağı olarak glikoz ile maya seçim ortamı içeren bir agar plaka ilgi bir floresan protein ile 25Q veya 72Q etiketi taşıyan maya klonları çizgi. Aynı zamanda, 25Q veya 72Q maya taşıyan çizgi maya pozitif bir kontrol olarak hizmet etmek için monomerik superfolder GFP optimize. Plakaları 30 derecede 2-3 gün kuluçkaya yatırın.
Her plaka dan üç tek koloniler kadar seçin ve karbon kaynağı olarak% 2 glikoz ile desteklenen sentetik tam orta beş mililitre aşılamak. Kültürleri bir gecede 30 derecede kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, her gece kültüründen 200 mikrolitreyi bir mikrosantrifüj tüpüne ve santrifüje aktarın.
Steril distile su ile en az üç kez yıkayın. GAL1 organizatörün indüksiyonunun bastırılmasına katkıda bulunabilecek tüm glikoz izlerini ortadan kaldırmak için hücreleri iyi yıkamak önemlidir. Hücreleri daha önce gösterildiği gibi hazırlayın ve polyQ füzyonlarının ekspresyonunu indüklemek için karbon kaynağı olarak %2 galaktoz içeren sentetik komple ortamda yeniden askıya alın.
Bir kontrol olarak, glikoz içeren ortamdahücreleri yeniden askıya alın. Hücreleri bir gecede bir tüp rotatorda 30 derecede kuluçkaya yatırın. Ertesi sabah, optik yoğunluğu nu her kültürün 600 nanometre'si bir spektrofotometre kullanarak ölçün.
Hücre yoğunluğunu, steril 96 kuyulu bir plakadaki 100 mikrolitre sentetik komple ortada 2'nin 2'sinin 600'ü kadar optik yoğunlukla eşitleştirin. Bir önceki kuyudan 20 mikrolitre numuneyi bir sonraki kuyuda 80 mikrolitre ortama borulandırarak her numunenin dört beş kat seyreltmesini hazırlayın. Hücreleri seçici plakalara göre tespit etmek ve iki gün boyunca 30 santigrat derecede kuluçkaya yatırmak için bir maya sabitleme aracı kullanın.
Plakaları bir görüntü dokümantasyon aygıtıyla görüntüleyin. Hücre kültürlerini bu töziçin hazırlayın ve sonra bir spektrofotometre kullanarak her kültürün OD600'ü ölçün. Hücreleri 96 kuyuluk plakadaki 300 mikrolitre de 1'lik bir OD600'e seyreltin.
Her örneği triplicate olarak hazırlayın. Titreme yetenekleri ile bir plaka okuyucu kuluçka plaka kuluçka. Numune sayısını, sıcaklığı 30 santigrat derece, emiciliği 600 nanometre, deneylerin uzunluğunu 24 saate ve ölçüm aralıklarını 15 dakikaya ayarlayın.
Sürekli sallayarak modunu seçin. Deneme yapıldığında, büyüme eğrisioluşturun ve bilimsel grafik yazılımını kullanarak eğrinin altındaki alanı ölçün. Verileri üç çoğaltma değeriyle bir XY tablosuna yapıştırın.
Büyüme eğrisi sol taraftaki grafik klasörü altında gösterilir. Eğrinin altındaki alanı ölçmek için sol üstteki analizi ve XY analizlerinde eğrinin altındaki alanı tıklatın. Hazırlanan hücreleri büyüme ortamında 10 kat seyrelterek bu işlemi başlatın.
Her numuneden 200 mikrolitreyi sekiz kuyulu bir görüntüleme odasına aktarın. Hücreleri standart geniş alan floresan mikroskobu kullanarak görüntüleyin. Görüntü edinimi için görüntüleme ayarlarını ayarlayın.
72Q agregalar dağınık 25Q sinyalden çok daha parlak olduğundan, floresan sinyalinin doygunluğuönlemek için genellikle farklı plazmidler arasında farklı bir kazanım ayarı kullanmak gerekir. Uygun bir görüntü işleme yazılımı kullanarak görüntüleri işleyin. Bu protokolde protein ekspresyonu düzeylerini incelemek için nokta lekesi kullanılır.
Tamponu, lysis tamponuna dört mikromofenietilsülfonil florür ve proteaz inhibitörü kokteyli ekleyerek protein lisatları üretmek için hazırlayın. Pelet santrifüj tarafından her gece kültür beş mililitre. 200 mikrolitre cam boncuk ve 200 mikrolitre likis tamponu ile hücreleri yeniden askıya alın.
Girdap 12 mermi için 30 saniye, mermi arasında buzlanma. 12, 000 kez G'de 10 dakika boyunca 4 santigrat derecede santrifüj edin ve süpernatant toplayın. Bir nitroselüloz membran üzerinde toplam protein eşit miktarda nokta için bir mikrofiltrasyon cihazı kullanın.
Membranı PBS ile önceden ıslavenin ve cihazı monte edin. Bir vakum kaynağına bağlayın ve vidaların sıkılmış olduğundan emin olun. Örnekleri yükleyin, vakumaçın ve yerçekimi tarafından membran filtre örnek sağlar.
PBS%05 Ara %5 yağsız sütte membranı 30 dakika boyunca blotlayın. Membranı bir gecede dört santigrat derecede birincil anti-bayrak antikoruile kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, pbs 05% Tween ile 10 dakika her membran üç kez yıkayın.
PBS%05 Ara %5 yağsız sütte floresan olarak etiketlenmiş ikincil antikorile membranı oda sıcaklığında bir saat kuluçkaya yatırın. PBS 05% Tween ile 10 dakika boyunca membran üç kez yıkayın. Daha sonra, bir amino leke dokümantasyon sistemi kullanarak membran görüntü.
Maya ya ifade 25Q veya 72Q HTT ekson bir maya optimize monomerik superfolder GFP veya maya optimize monomerik etiket BFP2 erimiş glukoz veya galaktoz orta gecede kültürlü ve ya agar plakaları üzerinde benekli ya da sıvı ortamda daha fazla kuluçkaya yatırıldı. 72Q maya optimize monomerik superfolder GFP önemli bir büyüme kusuru neden olurken. 72Q maya optimize monomerik etiket BFP2, floresan etiketin doğasının hücrelerde poliQ genişleme davranışını engelleyebilir belirten toksik olmayan 25Q benzerlerine benzer bir büyüme fenotipi görüntüler.
Floresan poliQ füzyonlarının floresan mikroskopi ile toplanması, 72Q maya optimize edilmiş monomerik süper klasör GFP'nin önemli ölçüde toplama gösterdiğini gösterirken, 72Q maya optimize edilmiş monomerik etiket BFP2 toksik olmayan 25Q muadillerine benzer diffüz sitoplazmik bir sinyal gösterir. Çeşitli poliQ füzyonlarının ekspresyon düzeyleri toksisiteyi etkileyebileceğinden, protein düzeylerini değerlendirmek için nokta lekeleri yapıldı. Hücre lisatlarının beş kat seyreltme sonuçları gösterilmiştir.
Bu tekniğin, tanımlanmamış ve floresan proteinlerin GFP varyantları ile hızlı bir şekilde karşılaştırılmasına olanak sağladığını unutmayın, ancak oligomerizasyonu doğrudan değerlendiremez. Bu prosedürü takiben, diğer önlemler, örneğin, memeli hücrelerinde ülser test floresan proteinlerin monomerik durumu gibi ek sorulara cevap için yapılabilir.
