荧光显微镜对聚焦超声的刺激

这种方法可以帮助回答机械生物学中的关键问题，例如生物样品如何对低强度超声波刺激产生的机械力作出反应。这项技术的主要优点是，它允许实验者将机械力无创地应用于样品，并实时测量各种生物周长。首先，使用垂直压钻在标准 35 毫米培养盘底部缓慢钻一个 12 毫米孔。

钻孔后，用刀片取出贴在盘子底部的塑料片，在外侧形成光滑的表面。接下来，在盘子的外底面涂抹一层薄薄的海洋级环氧树脂或胶水。在粘合剂的顶部，放置一个2点5微米厚的聚酯薄膜，用力压紧，以确保胶粘剂均匀地在薄膜和厚塑料表面之间扩散。

用手指以离心方式轻轻拉拉薄膜，形成平坦的表面。粘合剂干燥后，用95%乙醇短暂冲洗聚酯底盘。然后，紫外线消毒的菜，把它放在一个强大的254纳米紫外线激发源下。

调整持续时间和强度，提供每平方厘米约330毫焦耳的紫外线剂量。接下来，用所需的培养基以1比100的比例稀释市售的细胞外基质蛋白混合物。在冰上工作，防止基质聚合，并迅速将100微升的介质混合物应用到聚酯薄膜上。

将盖子放回盘子上，以保持无菌。一旦覆盖，孵育基质涂层，聚酯底部菜在细胞培养，二氧化碳缓冲孵化器在37摄氏度6至12小时。孵育后，吸进多余的介质，并在所需的密度下直接用细胞播种表面。

将水箱放在直立显微镜的目标下方。然后，使用市售的视光机分量，将样品支架定位在目标和传感器之间。确保平移阶段的移动部件和执行器位于水箱外或水线上方，以避免水损坏。

然后，在使用浸入式传感器之前，将浸气水加注到样品架的水平平面上。使用非腐蚀性、市售的视光剂元件，确保传感器在光学路径方面处于倾斜位置。这将确保任何反射波将定向远离样本。

将功能发生器的频率调整为传感器的标称峰值频率。然后，使用功能发生器的突发模式，创建所需持续时间和重复频率的正弦电压脉冲。接下来，将峰值到峰值电压调整到所需的值。

确保脉冲持续时间短于两个连续脉冲之间的经过时间。将功能发生器的输出连接到示波器的输入。使用示波器确认波形与所需信号相对应。

然后，将功能发生器的输出连接到适当大小的射频放大器的功率输入。使用与超声波传感器兼容的频率范围和声学强度的液压听器探头，在样品位置的目标的视场内小心地将探针的尖端聚焦。确保探头和传感器都浸入水浴中，并直观地将其声轴定位到水听器探头，对传感器执行总预对齐。

确保两者之间的距离对应于传感器的焦距。不要将水听器的尖端与水以外的任何物理物体碰撞，因为这将改变其涂层并影响测量。接下来，将水听器输出连接到示波器的信号输入之一。

然后，将同步触发器从功能生成器连接到另一个示波器输入。在示波器上同时可视化两个信号。接下来，在低占空比和低振幅下驱动几个超声波循环的传感器，以避免损坏探头。

请咨询水听器制造商的安全操作条件，以避免损坏水听器尖端。根据超声波从传感器表面到水听器的行驶时间调整 S 分旋旋钮。同步触发后，在示波器上查找水听器信号。

接下来，使用电动或手动 XYZ 级缓慢启动传感器。将传感器定位到与最大水听器信号相关的位置。现在，当光束对齐时，测量示波器上水听器输出的峰峰值振幅，以处理驱动传感器的各种电压。

确保不要超过水听器的压力限制。用含有5微摩尔的细胞渗透钙敏感染料（如氟-4 AM）所需的成像缓冲液替换细胞的培养基。然后，在37摄氏度的二氧化碳缓冲孵化器中孵育培养皿一小时。孵育后，用同样的无染料缓冲液小心清洗细胞。

然后，将盘子放在样品架中。在 490 纳米的蓝光照明下激发细胞。调整激发强度和摄像机曝光，避免过度漂白或像素饱和。

使用具有长工作距离的浸入式目标执行延时成像，提高图像质量，并减少不必要的反射。在这里，胶质母细胞在标准培养基的细胞外基质涂层聚酯薄膜上显示。这些细胞已经用钙敏荧光检测片孵育。

在此图像中，红点表示使用图像处理软件识别的单个荧光细胞。在超声波刺激10秒后，在许多感兴趣的地区都显示强健的钙高程。随着时间的推移，此处显示了激活的感兴趣区域的数量。

在超声波激活 10 秒后，发现大约 70% 的区域高于用户定义的阈值。在尝试此过程时，在进行荧光测量之前，必须记住对齐超声波束。