此方法可以帮助回答光学显微镜领域的关键问题，例如如何使用同一显微镜拍摄超分辨率图像和 FRET 图像。该技术的主要优点是，我们可以将三个不同的成像模块组合成一台显微镜，从而显著降低总体成本。该方法的可视化演示至关重要，因为激励路径的组装很难学习。
它们需要正确选择零件和敏感的光学校准。首先，通过 PCI 接口安装数据采集卡，并用它来将激光器连接到计算机。通过晶体管-晶体管逻辑输出控制激光的开、关行为，通过该卡的模拟输出控制激光的功率调整。
接下来，准备一个振动隔离光学表与反射镜和分束器，如这里所示，并随附文本协议中所述。通过将光纤适配器板首先安装在 z 轴转换支架中，将激光束组合成单模光纤。接下来，在笼板中安装无色双片镜头。
使用延长杆连接适配器和镜头以形成保持架。然后，使用一英寸厚的光学柱将笼子安装在光学桌子上。通过调整元件来对齐 647 纳米激光器，通过光纤获得最大的激光功率输出。
第一个激光器的对齐完成后，临时安装一对虹膜，然后一个一个地对齐其余的激光器。使用功率计检查每个激光器的对齐效率。请务必在适配器板前面留一个光圈，以减少激光的反射。
接下来，设计和安装放大镜，如随附的文本协议中所述。为了创造提取每个分子的 z 坐标所必需的散光效果，请将具有 10 米焦距的 3D 镜头放入盒式磁带中，并将其插入发射光束路径中。为了最大限度地减少连续多色荧光成像期间的振动，请使用放置在显微镜旁边的屏障滤镜轮中的发射过滤器。
在单分子 FRET 实验中，为了同时进行多色检测，请将另一个滤波器集放在发射分路器中。要使用光能激发设置衍射受限成像，首先将激发激光器的偶发角调整为照明臂的光显模式。接下来，分离 3D 镜头，并将旁路立方体插入发射分路器。
然后，插入磁镜，以扩大照明。设置完成后，根据预期结果拍摄样品的多通道、z 堆栈和/或时间失效的图像。要建立表面固定分子的多色单分子检测，首先将滤芯滚轮移动到空位置。
这将允许激光通过。然后，将激发激光的杂角调整到草皮角度，并分离磁光和 3D 镜头。接下来，首先将旁路立方体替换为校准立方体，使所有光线都通过所有通道，从而在发射分路器中使用三通道模式。
然后，在 DIC 下打开相机，并调整发射分路器的光圈，直到屏幕上出现三个完全分离的通道。转动发射分路器上的垂直水平调节控制旋钮，大致对齐三个通道。接下来，关闭相机，将校准立方体替换为三立方。
放置100纳米多通道珠的样品。在488纳米的激发下，100纳米多通道珠发出不同波长的光，实现三通道对齐。然后，打开相机和 488 纳米激光器，放大其中一个明亮的磁珠，最后通过再次转动调节控制旋钮来对齐三个通道。
现在样品就位后，使用弱激光，导航到具有合理点密度的区域，并调整激光功率和曝光时间，以实现可接受的信噪和光漂白水平。然后使用成像软件拍摄延时图像。对于超高分辨率成像，请首先插入 3D 镜头并移除磁镜镜头。
然后确定最佳激发激光的偶发角为草皮角度。为了找到SR成像的正确目标高度，使用DIC成像来查找细胞的中间平面。按单元格变为透明的高度确定平面。
确定所需的焦平面后，开始超高分辨率成像。在成像时，改变 405 纳米激光的功率，以保持闪烁点的合理密度。无需紫罗兰激光电源即可开始成像。
计算特定时间段的闪烁点数，并增加紫罗兰激光功率，使闪烁点的数量保持在视野中用户定义的计数阈值以上。通过检测成像帧中每个点的质心来分析数据，并从 X 和 Y 宽度提取每个点的 z 值。构建重建的图像，并在 3D 中可视化对象。
这种显微镜设置允许在不同的成像方法之间灵活且可重复切换，包括传统的荧光成像、基于单分子检测的超分辨率成像和多色单分子检测。为了在分子组合中揭示更精细的细节，超分辨率显微镜结合了数千个图像，如这个图像。然后重建这些图像以生成最终的超分辨率图像。
超分辨率技术允许高空间分辨率，提供其他技术无法看到的细节。这突出显示在此处显示的两个图像中。超分辨率图像显示与荧光图像相同的细菌调节 RNase，但允许单分子检测。
SmFRET 是另一种能够对纳米分辨率产生焦虑的方法。在这里，折叠的RNA分子被标记为绿色供体染料和红色接受染料。荧光强度轨迹可以从单个单个分子中提取，从而产生F FRET效率作为时间函数。
不要忘记，使用激光可能很危险，在执行此过程时，应始终采取佩戴眼罩或降低激光功率等预防措施。
