Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в механобиологии, такие как, как биологические образцы реагируют на механические силы, производимые низкой интенсивности ультразвуковой стимуляции. Основным преимуществом этой техники является то, что она позволяет экспериментатору неинвазивно применять механические силы к образцу и измерять различные биологические периметры в режиме реального времени. Для начала медленно просверлите 12-миллиметровое отверстие на дне стандартного 35-миллиметрового культурного блюда с помощью вертикального прессового сверла.
После пробурения, удалить кусочки пластика прилагается к нижней части блюда с помощью лезвия, чтобы создать гладкую поверхность на внешней стороне. Затем нанесите тонкий слой эпоксидной смолы морского класса или клей на внешнюю нижнюю поверхность блюда. В верхней части клея, место две точки пять микрон толщиной пленки полиэстер, нажав твердо, чтобы убедиться, что клей равномерно распространяется между пленкой и толстой пластиковой поверхности.
Аккуратно потяните пленку центробежным способом пальцами, чтобы создать плоскую поверхность. После того, как клей высохнет, кратко промыть полиэфирное нижнее блюдо с 95%этанола. Затем УФ стерилизовать блюдо, поместив его под сильный 254 нанометров УФ-источник возбуждения.
Отрегулируйте продолжительность и интенсивность, чтобы доставить УФ дозу примерно 330 миллиджоулей на квадратный сантиметр. Затем разбавьте коммерчески доступную внеклеточную матричную белковую смесь с желаемой культурной средой в соотношении от одного до 100. Работа на льду, чтобы предотвратить матричную полимеризацию, и быстро применить 100 микролитров средней смеси на полиэфирную пленку.
Поместите крышку обратно на блюдо для поддержания стерильности. После того, как покрыты, инкубировать матрицы покрытием, полиэстер нижней посуды в клеточной культуре, двуокиси углерода буфера инкубатора на 37 градусов по Цельсию в течение шести до 12 часов. После инкубации, аспирировать избыток среды и непосредственно семян поверхности с клетками при желаемой плотности.
Поместите резервуар для воды под цель вертикально микроскопа. Затем, используя коммерчески доступные оптомеханические компоненты, распо положение держателя образца между целью и предуцом. Убедитесь, что движущиеся части и приводы этапов перевода находятся либо за пределами резервуара, либо над ватерлий, чтобы избежать повреждения водой.
Затем заполните бак деионизированной и дегазизированной водой до горизонтальной плоскости держателя образца, прежде чем использовать трансдуцер погружения. Используя некоррозиотельные, коммерчески доступные оптомеханические компоненты, убедитесь, что предук в косом положении по отношению к оптическому пути. Это гарантирует, что любые отраженные волны будут направлены от образца.
Отрегулируйте частоту генератора функции до номинальной пиковой частоты предуцатора. Затем создайте синусоидальный импульс напряжения нужной продолжительности и частоты повторения, используя режим всплеска генератора функции. Затем отрегулируйте пиковое до пикового напряжения до желаемого значения.
Убедитесь, что продолжительность импульса короче, чем прошлое время между двумя последовательными импульсами. Подключите выход генератора функций к входу осциллоскопа. Используйте осциллоскоп, чтобы подтвердить, что форма волны соответствует желаемому сигналу.
Затем подключите выход генератора функций к вводу мощности усилителя RF правильного размера. Используя гидрофонный зонд, который работает с частотным диапазоном и акустической интенсивностью, совместимой с ультразвуковым предуцатором, тщательно привнесите наконечник зонда в фокус в поле зрения цели на положение образца. Убедитесь, что зонд и предук погружаются в водяную баню и выполняют грубое предварительное выравнивание предуцатора, визуально позиционя его акустическую ось к гидрофону зонда.
Убедитесь, что расстояние между ними соответствует фокусной длине предуцера. Не удар кончик гидрофона с любым физическим объектом, кроме воды, так как это изменит его покрытие и влияет на измерение. Затем подключите выход гидрофона к одному из входных сигналов осциллоскопа.
Затем подключите триггер синхронизации от генератора функций к другому входу осциллоскопа. Визуализуй оба сигнала одновременно на осциллоскопе. Далее, диск предуцера с несколькими ультразвуковыми циклами на низком цикле службы и низкой амплитуды, чтобы избежать повреждения зонда.
Проверьте с производителем гидрофона безопасные условия эксплуатации, чтобы избежать повреждения кончика гидрофона. Отрегулируйте ручку S-разделения в зависимости от времени в пути ультразвука от поверхности превесяка к гидрофону. Ищите сигнал гидрофона на осциллоскопе после спускового крючка синхронизации.
Затем медленно приводим предуцатора с помощью моторизованной или ручной ступени XY. Распоить предуцатор в положении, которое коррелирует с максимальным гидрофонным сигналом. Теперь, когда луч выровнен, измерьте пик-пик амплитуды выхода гидрофона на осциллоскопе для различных напряжений, движущих преобразоваца.
Убедитесь в том, чтобы не превышать предел давления гидрофона. Замените культурную среду клетки желаемым буфером изображений, содержащим пять микромолей клеток, чувствительных к кальцию красителей, таких как Fluo-4 AM. Затем инкубировать культурную тарелку в инкубаторе с углекислым газом при 37 градусах по Цельсию в течение одного часа. После инкубации тщательно промыть клетки с тем же буфером, свободным от красителя.
Затем поместите блюдо в держатель образца. Возбуждайте клетки с помощью синего освещения на 490 нанометров. Отрегулируйте интенсивность возбуждения и экспозицию камеры, чтобы избежать чрезмерного отбеливания или насыщения пикселей.
Выполняйте покадровую визуализацию с помощью цели погружения с большим рабочим расстоянием для улучшения качества изображения и уменьшения нежелательных отражений. Здесь клетки глиобластомы показаны на внеклеточной матричной полиэфирной пленке в стандартной культурной среде. Эти клетки были инкубированы с кальцием чувствительных флуоресцентных репортер.
На этом изображении красные точки представляют отдельные флуоресцентные клетки, идентифицированные с помощью программного обеспечения для обработки изображений. При стимуляции в течение 10 секунд с ультразвуком, надежные высоты кальция были визуализированы во многих областях, представляющих интерес. Количество активированных регионов, представляющих интерес, отображается здесь с течением времени.
После 10-секундной активации С ПОМОЩЬю ультразвука было установлено, что примерно 70% регионов находятся выше пороговых значений, определяемых пользователем. При попытке этой процедуры, важно помнить, чтобы выровнять ультразвуковой луч, прежде чем делать измерение флуоресценции.
