这种经过改进的 ATAC-seq 协议引入了一种新的解压缓冲液，可将线粒体读取从 50% 降至 3% 以下。线粒体污染的减少将使研究人员能够执行更高效的 ATAC-seq，测序成本降低 50%。我们已经在人类原发性PBMC、人类原生单核细胞、小鼠树突状细胞、黑色素瘤细胞系中验证了这种新的AC-seq协议。我们相信它将在广泛的细胞类型中有效。
在细胞激活和选择过程中最大限度地减少样品损失对于使用 ATAC-seq 获得高质量结果至关重要。我们将演示如何使用基本实验室设备处理来自珍贵样品的少量细胞。首先，在37摄氏度的水浴中解冻一小瓶以前分离的CD4+T细胞，直到冰刚刚融化。
然后轻轻地将细胞转移到一个15毫升的圆锥形管中，该管含有9毫升预加热的完整RPMI。将细胞在1500倍的G和4摄氏度的离心，6分钟。然后丢弃上一提液，轻轻地将颗粒重新在两毫升完整的 RPMI 中。
重复离心后，丢弃上经剂，并轻轻地在0.5毫升的完整RPMI中重新暂停细胞。使用血细胞计计算细胞数。使用完整的 RPMI，将电池悬浮液密度调整为板 50，000 CD4+细胞，每井 96 井圆底板的 200 微升。
然后，准备磁珠，等价12.5微升的人类T-Activator CD3/CD28珠子每个AC-seq样品到1.5毫升管。将1毫升1x PBS加入管子，放在磁铁上一分钟清洗珠子。小心地拆下并丢弃透明上清剂，然后从磁铁上拆下管子。
每个 ATAC-seq 样品将珠子重新在 13 微升中，提供完整的 RPMI。要使用调整后的浓度激活 CD4+T 细胞，请将 500，000 个细胞收集在 15 毫升圆锥形管中 2.1 毫升的完整 RPMI 介质中。加入12.5微升的人类T-Activator珠子，在前几步准备和清洗，然后通过反转管子轻轻混合。
然后用珠子轻轻地将细胞转移到无菌储液罐中。使用多通道移液器，板200微升细胞与珠子每井的圆底96井板，并在37摄氏度，5%CO2培养箱48小时孵育。完成孵育后，在423倍G和室温下将板离心8分钟。
从每孔中去除100微升的介质，在丢弃前将其收集在锥形管中，以确认没有珠子损失。然后将细胞颗粒重新在剩余的100微升的介质中，并在1.5毫升的管中收集所有内容。要分离CD4+细胞，在一毫升完整的RPMI中，将50微升预洗的CD4结合珠子加入50万个细胞中，然后反转混合。
在4摄氏度下孵育20分钟，同时每6分钟用手轻拂一次混合。将管子放在磁铁上两分钟，直到上清液清除，然后取出并丢弃。从磁铁上拆下管子。
将珠状细胞重新用一毫升PBS和2%FCS洗净，将管子放回磁铁上一分钟。丢弃透明上清剂，并重复此过程，总共三次洗涤。最后洗涤后，将管子放在磁铁上一分钟。
取出它，丢弃上一液，然后将颗粒放在冰上。接下来，进行核分离，将珠子和细胞重新在50微升的冷解解缓冲液中，并立即在500G、4摄氏度的离心机中，10分钟。取出并丢弃上一液。
要执行转置酶反应，用50微升Tn5转置酶混合物重新暂停分离的核颗粒。在37摄氏度下在热循环器中孵育30分钟，盖子设定为40摄氏度，完成后在4摄氏度下保持。热循环后，立即执行快速台式离心机旋转。
将管子放在磁铁上一分钟，从产品中去除珠子。在不从磁铁上去除管，将透明上清液转移到DNA纯化柱。用 250 微升 PB 缓冲器清洗一次柱，用 750 微升 PE 缓冲器洗两次。
然后添加 10 微升洗脱缓冲液来洗脱样品。在无核酸酶PCR管中设置初始PCR扩增反应。将 PCR 管放入热循环器中，然后运行 PCR 扩增程序。
然后完成剩余 45 微升 PCR 反应的 PCR 扩增，如手稿中所述。将 PCR 管放在热循环器中并运行程序。完成放大后，使用 PCR 清理套件按照制造商的协议进行净化库，在洗脱缓冲液的 25 微升中洗脱。
将下一代测序器上准备好的库按每个样本的平均读取深度 4200 万次。这种改进的 ATAC-seq 协议产生了一个最终库，每个微升的纳米图大于一个，用于测序。质量控制显示DNA片段在200到1000个碱基对之间，并且通过这些高质量的库进行了进一步的测序。
按照该协议编写的库显示只有3%的线粒体污染。在生物复制中，可用读取的高百分比是足够的恒定的。该协议在技术复制和生物复制之间提供了高度可重复的结果。
此外，该协议需要 48 小时，而不是前面描述的一周或一周以上，从而实现一致和高效的激活，如可重现的测序结果所证明的那样。此外，分析管道准确地调用了预测的 ATAC-seq 峰值。测序结果分析显示，在人类T细胞活化期间，染色质状态发生了明显变化。
在激活前和激活后48小时内，在6个样品之间确定了开放染色质的可分色可访问区域。确保用冷冻试剂和材料进行核解解反应，以最大限度地回收完整的核。我们改良的核解液缓冲液对细胞更温和，并最大限度地减少了线粒体DNA的污染。
我们期待这种经过修改的解液缓冲液也应用于单核 ATAC-seq。我们知道，该协议将允许研究人员以降低成本的价格生成更高质量的 ATAC-seq 数据，从而帮助推进表观遗传领域。该协议简单、快速，不需要任何危险试剂或仪器，因此很容易为 ATAC-seq 的新功能获取。
