实时监测细胞因子分化人原代T细胞中的线粒体呼吸

线粒体代谢是T细胞耐久性和记忆力的重要调节剂。因此，测量线粒体呼吸可以对T细胞的性质提供重要的见解。海马机可以实时测量活人原发性T淋巴细胞中线粒体呼吸的各种元素，而无需任何标记。

该方法非常适合监测T细胞的适应性和记忆潜力，是癌症免疫治疗成功的重要预测因素。首先，通过将每百万个细胞中12.5微升微粒转移到微量离心管中，并在管中每12.5微升微升珠子中加入12.5微升PBS来洗涤CD3 / CD28微珠。然后，将微量离心管放在合适的磁铁上一分钟，丢弃缓冲液，并将微珠重悬于原始体积的T细胞培养基中。

接下来，以1至2个微珠与细胞的比例每百万个细胞加入12.5微升的微珠，并将细胞分成两个条件，每个条件中约有500万个细胞。然后，将正确体积的细胞因子添加到每种条件下，并将细胞转移到多孔板中。将细胞在37摄氏度和5%二氧化碳下孵育三天。

孵育三天后，制备具有双倍浓度细胞因子的新鲜T细胞培养基。通过将每个孔的一半体积转移到新孔中来重悬并分裂细胞。然后，向每个孔中加入相同体积的新鲜制备的T细胞培养基。

对于细胞外通量测定，制备含有碳酸氢钠，Cell-Tak和氢氧化钠的包衣溶液。然后，打开新鲜的XF细胞培养板，并向每个孔中加入12微升新鲜制备的包衣溶液，确保包衣溶液均匀分布在所有孔的底部。将板在室温下孵育，盖上盖子30分钟。

然后，丢弃所有孔中剩余的液体溶液。用200微升无菌水清洗板，并丢弃液体。接下来，用200微升细胞培养级无菌PBS洗涤板。

丢弃液体后，让板在室温下干燥30分钟。为了将T细胞接种在XF细胞培养板中，根据实验设置将合适的XF RPMI培养基与葡萄糖，丙酮酸和谷氨酰胺混合来制备50毫升测定培养基。在非二氧化碳调节的培养箱中将制备的培养基加热至37摄氏度，并将pH值设置为7.4。

确保有足够的培养基用于种植细胞和制备寡霉素和FCCP溶液。接下来，设计一个板布局，每个孔的细胞数量增加，用于优化或分析运行。使用四个充满培养基并注入培养基的孔进行背景测量。

在计数先前制备的T细胞后，根据板布局将适当数量的细胞移液到先前包衣的XF细胞培养板的每个孔中。要将T细胞粘附到涂覆的表面上，离心XF细胞培养板。然后，用200微升测定培养基洗涤细胞。

丢弃培养基，并加入180微升新鲜测定培养基。在确保细胞附着并均匀分布在孔表面后，将XF细胞培养板在非二氧化碳调节的加热柜中以37摄氏度孵育30分钟。对于优化运行，在测定培养基中制备寡霉素和FCCP的工作溶液。

然后，将寡霉素或FCCP的工作溶液加载到传感器墨盒的注射口中。确保没有注入口只包含空气。用测定培养基填充所有空端口。

然后，通过轻轻敲击桌子上板的边缘来去除注射口中的潜在气泡。对于测定运行，制备20微摩尔抗霉素A溶液。然后，根据板布局，将20微升寡霉素或FCCP加载到传感器墨盒的注射端口A中，并向所有孔的注射口B添加22微升抗霉素A。

在具有代表性的寡霉素优化运行中，当累积浓度达到1微摩尔时，达到氧气消耗率或OCR的平台。从这个浓度开始，OCR没有进一步降低。对于用浓度增加的解耦FCCP处理的细胞，OCR水平增加到0.2微摩尔FCCP，然后达到平台，表明获得了完全解耦。

在具有代表性的细胞浓度优化运行中，使用200， 000个细胞运行的初始OCR大约是400， 000个细胞的一半。FCCP处理后，200， 000个细胞的最大OCR为每分钟61.6皮摩尔，400， 000个细胞的最大OCR为每分钟190.4皮摩尔。在寡霉素治疗后，200， 000个细胞的OCR崩溃成个位数，并且低于400， 000个细胞的运行。

研究细胞因子白细胞介素-2和白细胞介素-15对T细胞代谢的影响表明，白细胞介素-15培养的细胞具有更高的最大呼吸和备用呼吸能力。然而，基础呼吸和ATP产生没有受到影响。研究人类T细胞中的线粒体代谢为它们的耐久性和生存潜力提供了重要线索。

这导致对T细胞适应性的了解增加，并最终可以提高癌症免疫治疗反应率。