פרוטוקול ATAC-seq שונה זה מציג מאגר תזהמה חדש המפחית קריאות מיטוכונדריות מזהמים מ 50% לפחות מ 3%הזיהום המיטוכונדריאלי ירד יאפשר לחוקרים לבצע יעיל יותר ATAC-seq עם ירידה של 50% בעלויות רצף. אמתנו פרוטוקול ATAC-seq חדש זה במחשבים אישיים ראשוניים אנושיים, מונוציטים ראשוניים אנושיים, תאים דנדריטיים של עכברים וקווי תאים מלנומה. אנו מאמינים שזה יהיה יעיל במגוון רחב של סוגי תאים.
מזעור אובדן הדגימה במהלך תהליך ההפעלה והבחירה של התא הוא קריטי להשגת תוצאות באיכות גבוהה באמצעות ATAC-seq. אנו נדגים כיצד לטפל במספר קטן של תאים מדגימות יקרות באמצעות ציוד מעבדה בסיסי. כדי להתחיל, להפשיר בקבוקון אחד של תאי CD4 + T מבודדים בעבר באמבט מים צלזיוס 37 מעלות עד הקרח רק נמס.
ואז בעדינות להעביר את התאים לצינור חרוט 15 מיליליטר המכיל תשעה מיליליטר של RPMI מלא מחומם מראש. צנטריפוגה התאים ב 1, 500 פעמים G, וארבע מעלות צלזיוס, במשך שש דקות. ואז להשליך את supernatant, בעדינות resuspend את גלולה בשני מיליליטר של RPMI מלא.
לאחר חזרה על הצנטריפוגה, השלך את העל-טבעי, ולחץ בעדינות על התאים ב- 0.5 מיליליטר של RPMI מלא. השתמש בהמוציטומטר כדי לספור את התאים. באמצעות RPMI מלא, להתאים את צפיפות מתלי התא לצלחת 50, 000 CD4 + תאים ב 200 microliters ל הבאר של צלחת 96 גם עגול למטה.
לאחר מכן, כדי להכין חרוזים מגנטיים, aliquot 12.5 microliters של גם T-Activator אנושי CD3/CD28 חרוזים לכל מדגם ATAC-seq לצינור 1.5 מיליליטר. מוסיפים מיליליטר אחד של 1x PBS לצינור, וממקמים אותו על מגנט למשך דקה אחת כדי לשטוף את חרוזים. בזהירות להסיר ולהשליך את העל טבעי ברור, ולהסיר את הצינור מן המגנט.
יש למצות את חרוזים ב-13 מיקרוליטרים של דגימת RPMI מלאה לדגימה של ATAC-seq. כדי להפעיל את תאי CD4+T עם הריכוז המותאם, לאסוף 500, 000 תאים ב 2.1 מיליליטר של מדיום RPMI מלא בצינור חרוט 15 מיליליטר. הוסיפו 12.5 מיקרוליטרים של גם בחנוזי T-Activator אנושיים, שהוכנו ונשטפו בשלבים קודמים, ומערבבים בעדינות על ידי היפוך הצינור.
לאחר מכן מעבירים בעדינות את התאים, עם חרוזים, למאגר סטרילי. בעזרת פיפטה רב-ערוצית, צלחת 200 מיקרוליטרים של תאים עם חרוזים ל הבאר של צלחת עגולה 96 באר, וחנקובות ב 37 מעלות צלזיוס, 5%CO2 אינקובטור במשך 48 שעות. לאחר הדגירה המלאה, צנטריפוגה הצלחת ב 423 פעמים G, וטמפרטורת החדר, במשך שמונה דקות.
הסר 100 microliters של בינוני מכל באר, ולאסוף אותו בצינור חרוט לפני השלכת, על מנת לאשר שום אובדן חרוזים. ואז תן שימוש חוזר לכדור התא ב-100 המיקרוליטרים הנותרים של המדיום, ואאסוף הכל בצינור של 1.5 מיליליטר. כדי לבודד CD4+תאים, הוסף 50 מיקרוליטרים של חרוזים מצומדים CD4 שנשטפו מראש ל- 500, 000 תאים במיליליטר אחד של RPMI מלא, והתהפך כדי לערבב.
דגירה במשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס, תוך כדי תנועה ידנית כל שש דקות כדי לערבב. מניחים את הצינור על המגנט במשך שתי דקות, עד על טבעי ברור, ולאחר מכן להסיר ולהשליך. הסר את הצינור מהמגנט.
לשטוף את התאים כבול חרוזים על ידי שימוש חוזר אותם במיליליטר אחד של PBS, בתוספת 2% FCS, ולמקם את הצינור בחזרה על המגנט במשך דקה אחת. השלך את העל-טבעי הברור, וחזור על תהליך זה במשך שלוש שטיפות בסך הכל. לאחר הכביסה הסופית, מניחים את הצינור על המגנט למשך דקה אחת.
מוציאים אותו, משליכים את העל-טבעי, ומ מניחים את גלולת הקרח על הקרח. לאחר מכן, כדי לבצע בידוד גרעיני, תן שימוש חוזר חרוזי ותאים ב 50 microliters של חיץ תמוגה קרה, וצנטריפוגה מיד ב 500 G, ארבע מעלות צלזיוס, במשך 10 דקות. הסר והשליך את העל-טבעי.
כדי לבצע את תגובת transposase, תן שימוש חוזר גלולת הגרעינים המבודדים עם 50 microliters של Tn5 טרנספוזאז לערבב. דגירה בתרמוציקלר במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, עם המכסה להגדיר 40 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן להחזיק בארבע מעלות צלזיוס כאשר הושלמה. מיד לאחר התרמוצ'ילי, בצעו ספין-למטה מהיר של צנטריפוגה על הספסל.
מניחים את הצינור על המגנט למשך דקה אחת כדי להסיר את חרוזים מהמוצר. מבלי להסיר את הצינור מהמגנט, העבר את העל-טבעי הברור לעמוד טיהור דנ"א. לשטוף את העמודה פעם אחת עם 250 microliters של מאגר PB, ופעמיים עם 750 microliters של מאגר PE.
לאחר מכן הוסיפו 10 מיקרוליטרים של מאגר אלוטיון כדי לחמק מהדגימה. הגדר את תגובת ההגברה הראשונית של PCR בצינור PCR ללא גרעין. מקם את צינור PCR לתוך התרמוצ'יקלר והפעל את תוכנית ההגברה של PCR.
לאחר מכן השלימו את הגברה הסופית של PCR של 45 המיקרוליטרים הנותרים של תגובת PCR, כמתואר בכתב היד. מקם את צינור PCR בתרמוציקלר והפעל את התוכנית. לאחר הגברה מלאה, לטהר את הספריות באמצעות ערכת ניקוי PCR, בעקבות פרוטוקול היצרן, eluting ב 25 microliters של מאגר elution.
רצף הספריות המוכנות ברצף הדור הבא לעומק קריאה ממוצע של 42 מיליון קריאות לכל מדגם. פרוטוקול ATAC-seq משופר זה הפיק ספריה סופית של יותר מננוגרם אחד לכל מיקרוליטר לתהפה. בקרת איכות הראתה שברי דנ"א בין 200 ל-1,000 זוגות בסיסים, ותבוצע רצף נוסף עם ספריות איכותיות אלה.
ספריות שהוכנו בעקבות פרוטוקול זה הראו זיהום מיטוכונדריאלי של 3% בלבד. האחוז הגבוה של קריאות שמיש הוא קבוע מספיק על פני שכפולים ביולוגיים. פרוטוקול זה סיפק תוצאות הניתנות לשחזור רב על-פני שכפולים טכניים, כמו גם שכפולים ביולוגיים.
בנוסף, פרוטוקול זה לקח 48 שעות, במקום שבוע אחד או יותר כפי שתואר קודם לכן, וכתוצאה מכך הפעלה עקבית ויעילה, כפי שהוכח על ידי תוצאות רצף לשחזור. יתר על כן, פסגות ATAC-seq חזוי נקראו במדויק על ידי צינור הניתוח. ניתוח תוצאות רצף גילה שינויים ברורים במצב כרומטין במהלך הפעלת תא T אנושי.
אזורים נגישים להבחנה של כרומטין פתוח זוהו בין שש דגימות לפני ו 48 שעות לאחר ההפעלה. ודא שתגובת תות הגרעין מבוצעת עם ריאגנטים וחומרים צוננים, על מנת למקסם את ההתאוששות של גרעינים שלמים. מאגר תות הגרעינים שלנו שונה עדין יותר על התאים, וממזער דנ"א מיטוכונדריאלי מזהם.
אנו מצפים לכך שמאגר תזה שונה זה יוחל גם על ATAC-seq בגרעין יחיד. אנו יודעים שפרוטוקול זה יאפשר לחוקרים לייצר נתוני ATAC-seq באיכות גבוהה יותר בעלות מופחתת, ויעזור להעביר את השדה האפיגנטי. הפרוטוקול הוא פשוט, מהיר, ואינו דורש כל reagents מסוכן או מכשירים, מה שהופך אותו נגיש בקלות עבור אלה חדשים ATAC-seq.
