P2X7 受体实时活细胞流式细胞仪检测成人神经祖细胞中的钙影响、毛孔形成和吞噬作用

P2X7受体用途极其广泛，根据存在激动剂的数量，其功能也不同。这样，P2X7具有不同的功能，可以调节许多不同的系统的生理。该协议允许研究P2X7受体的三个主要功能。

它是一种快速、可重复和可量化的方法，用于理解其功能。我们专注于P2X7受体如何在神经祖细胞中调节。然而，此方法可以很容易地适应任何细胞类型。

在尝试这个程序之前已经阅读了足够多的文献的学生可以在一天中学会，并且能够在两到三次尝试后独自完成这一切。开始这个程序，从成人小鼠的辅助区和海马获得神经祖细胞，如文本协议中所述。将培养物保持在 37 摄氏度，二氧化碳含量为 5%。

神经球应在7至10天后形成，是通道零补助区培养，15至20天后在海马培养。在初始通道零培养阶段后，必要时每 7 到 10 天使用生物安全柜和标准组织培养实践通过一次。当球体直径达到 150 到 200 微米时，通过球体。

在15毫升管中收集球体和介质，以低速旋转两分钟。去除介质，在37摄氏度下用分离试剂孵育细胞7至10分钟，具体取决于球体的大小。最后，使用血细胞计或自动细胞计数器计算细胞。

我们悬浮在一毫升无钙钠介质中的单个细胞。然后向细胞加载每毫升钙指示器染料两尼英格和 10 微升 5%普兰酸。在37摄氏度下孵育细胞30分钟。

通过加入三到五毫升无钙钠介质并轻轻离心来清洗细胞。取出上一代，在无钙钠介质中重新悬浮细胞，第二次清洗。将细胞重新悬浮在一毫升无钙钠介质中。

然后将细胞放在冰上，让它们去酯化30分钟。再次清洗细胞，添加三到五毫升的钾介质和离心一样。重新悬浮钾培养基中的细胞后，将细胞分氟或FACS管中，每500微升每500微升的浓度为100万个细胞。

将 FACS 管放在冰上，直到细胞准备好进行分析。不要将细胞长时间留在冰上，但请尽快开始测定。对于某些样品，使用文本协议中描述的P2X7受体特异性抑制剂预孵育细胞。

在运行第一个样品前几分钟，将氯化钙加入一毫升的最终浓度，并将管子放在37摄氏度的水浴中进行恢复。将干净的小型磁力搅拌器放入 FACS 管中，将管放在时间模块中，该管与循环的 37 摄氏度水浴相连，以控制样品温度。选择低搅拌速度，以确保样品的移动，而不引入涡流效应。

将水壶和管适配器放在样品平台上，然后关闭 FACS 机器的操纵臂。启动样本采集，以大约 1，000 个事件/秒的速度运行样本三分钟。在 40 秒标记下，快速取出管子并添加 P2X7 激动剂。

一毫摩尔 ATP 或 300 微摩尔 BzATP。然后更换管子以继续采集。当第一个样品被记录时，用氯化钙准备第二个样品。

将它放在37摄氏度，让细胞在分析前有足够的时间热身。第一个样品完成后，通过运行水样清洁进气口。然后，第二个样本的采集可以开始像以前一样。

始终清洁样品之间的进气口。创建单细胞悬浮液，并节省几毫升的调节介质。使用该介质将细胞重新悬浮，每100微升细胞浓度为100万，然后将细胞放在冰上直到准备就绪。

在进行测定之前，加入900微升钾介质，最终体积为1毫升。将管子放在37摄氏度的水浴中10分钟，以恢复。如果适用，用包括P2X7特异性抑制剂在内的治疗预孵化细胞。

在进行检测之前，立即在FACS管中加入25微摩尔溴化乙基。然后加入磁力搅拌器，将管子放在 FACS 机器上，然后开始像以前一样进行采集。为了诱导细胞膜中毛孔的形成，在采集开始40秒后加入1毫摩尔ATP或100微摩尔BzATP。

以大约 1，000 个事件/秒运行示例，为期 6 分钟。当第一个样本运行时，从冰中摄第二个样本，并放在37摄氏度的水浴中，以便让细胞在分析前有足够的时间恢复。第一次样品采集完成并清洁进气口后，第二个样品可以放在机器上开始记录。

我们暂停在条件介质中的单个细胞，并把它们悬浮到FACS管中，每100微升的浓度至少为100万个。用钠基将细胞稀释到每毫升100万个细胞的最终浓度，并放在冰上，直到进行分析。使用一微米宽的G珠作为噬菌体靶点进行实时吞噬分析。

在运行第一个样本之前，将细胞转移到37摄氏度的水浴中，并孵育约7至10分钟，使细胞恢复。将任何需要预孵化的治疗方法添加到各自的管中，包括ATP、氧化ATP、细胞基林D和4%半成甲醛。5%的人血清无需预孵育。

如果几乎同时添加治疗，样品可以连续运行，而其他样本则继续孵育，因为它们的孵育时间不同。使用磁力搅拌器将样品放在圆度仪上，并像以前一样开始采集样品。采集开始 15 到 20 秒后，从机器上取出样品管，并添加 5 微升未稀释的 YG 珠子。

将样品 FACS 管返回仪器并继续采集。以大约 1，000 个事件/秒的速度运行样本 7 到 8 分钟。当第一个样本运行时，从冰上拿第二个样本，放在37摄氏度的水浴中，让细胞在分析前有足够的时间恢复。

完成第一个样品并清洁进气后，开始采集第二个样品。随着时间的推移，钙的流入在海马和辅助区神经祖细胞中通常相似。在第42个标记上增加了激动剂。

BzATP快速激活P2X7受体，打开离子通道，允许钙流入氟-8和荧光。ATP 应用通常会导致钙流入的渐进性。与 BzATP 相比，它与 P2X7 的亲和力较低，也会导致 G 蛋白耦合受体激活。

在应用激动剂的ATP和BzATP后，时间解析流细胞学实时捕获通过跨膜孔隙进入细胞的溴化乙烷。这种效应被P2X7特异性抑制剂衰减。ATP浓度反应测定说明了激动剂浓度对P2X7孔径形成的影响，使用溴化乙基氟化物的荧光变化。

在这里，P2X7受体参与的噬菌体由海马和辅助区神经祖细胞实时显示。YG乳胶珠的未抑制噬菌体水平被确立为正对照。ATP抑制了YG珠的噬菌体病，其程度与非特异性抑制剂相同，即半成甲醛固定和活性辛聚合抑制剂细胞基莱辛D.5%血清废除了所有先天邻生性噬菌体。

保持健康的细胞数量和减少冰上时间对于获得可重复的结果至关重要。通过在整个细胞测定中使用相同的ATP批次，可以最大限度地减少变异性。我们在这里演示的流动细胞学的时分结果是唯一可以继续选择流量和目标子总体变化数量的信息。

替代方法是荧光显微镜和荧光盘片读取器。然而，由于荧光亲和力程序，此方法不能连续测量荧光变化。P2X7 是唯一的多模式。

在感兴趣的细胞上发现其表达，为调查人员提供了一系列独特的问题供其探索。